牡蛎重金属胁迫的组学响应及MTF-1转录调控机制研究

题名	牡蛎重金属胁迫的组学响应及MTF-1转录调控机制研究
作者	孟杰
学位类别	博士
答辩日期	2010-05
授予单位	中国科学院研究生院
导师	张国范
关键词	牡蛎重金属胁迫表达谱基因组转录调控
学位专业	海洋生物学
中文摘要	近年来，海域重金属污染日益严重。牡蛎营固着生活，能高度累积重金属，而不被重金属毒害，其被广泛用于海域重金属污染的检测。牡蛎全基因组测序的完成使我们可以从全基因组的视角进行牡蛎重金属累积分子机制的研究。本实验，一方面我们从组学研究的角度，利用比较基因组学和RNA-seq测序的方法，对重金属胁迫相关基因进行了全基因组的筛选和鉴定，绘制了牡蛎重金属调控网络模型。通过不同物种间比较和分析，初步解释了牡蛎重金属耐受机制。另一方面，我们对牡蛎体内唯一重金属转录因子MTF-1进行了功能验证。通过克隆表达，RNA干扰和凝胶迁移电泳分析等，阐明了MTF-1基因的转录调控机制。利用荧光定量PCR的方法，对MTF-1下游调控基因的功能进行了进一步验证，阐明了它们在重金属离子胁迫中的关键作用。主要结论如下： 1. 重金属RNA-seq的总体分析：（1）生理实验结果表明牡蛎能够高度累积海水中溶解的重金属Cd和Pb，对Cu，Zn和Hg没有显著的富集。分析Zn，Cd，Cu，Hg，Pb和Zn+Cd 应激的RNA-seq数据，结果表明在应激条件下，牡蛎下调基因数目多于上调基因数目，重金属更倾向于抑制基因表达；MMC模块化聚类分析结果表明重金属毒害显著影响了牡蛎蛋白结合过程，胞内稳态平衡过程，化学防御通路的代谢以及重金属转运蛋白通路相关基因；重金属应激基因存在paralog分化，这些paralog对在应激下产生了表达分化，有利于牡蛎适应环境变化。(2)主成分分析结果表明，重金属应激存在显著的组织和时间差异。鳃在12 h应激条件下起主要的防御作用，内脏团在9 d累积条件下起主要作用。(3)对Zn，Cd和Zn+Cd的RNA-seq数据分析表明，Zn+Cd联合应激能够减少牡蛎体内Zn或Cd的累积。Zn胁迫倾向于影响内脏团中的蛋白代谢过程，Cd胁迫倾向于影响内脏团脂代谢过程。 2. 重金属关键基因家族和代谢通路分析，构建代谢调控网络（1）基因家族层面：牡蛎扩张的基因家族CYP450在重金属防御中发挥关键作用。根据序列相似性，CYP450分成四类，Clan2显著扩张且倾向于存在串联重复现象；重金属螯合基因金属硫蛋白（metallothionein, MT）在牡蛎中存在MTI和MTIV两个亚家族。MTI上游存在成簇分布的MRE基序，受MTF-1转录调控能力更强。三个MTI基因表达模式相似，对重金属离子亲和力顺序为：Cd>Hg>Zn>Pb>Cu。（2）代谢通路层面：重金属应激12 h，游离谷胱甘肽和植物螯合肽代谢通路合成基因表达升高，而在9d应激下受到抑制。说明谷胱甘肽在重金属应激条件下，起到第一道防线的作用。异生物质代谢通路，ABC转运蛋白通路在重金属胁迫下显著富集，起到解毒重金属的作用。（3）基因家族和代谢通路的全基因组比较分析：从基因家族角度，将牡蛎重金属代谢的关键基因分成应激类，结合类，抗氧化酶类，转运类和螯合类。牡蛎这些关键基因家族表现出扩张趋势。从代谢通路角度，牡蛎扩张的KOs在iPath中倾向于共表达，且共表达的代谢通路在牡蛎重金属防御中发挥关键作用。KEGG数据库中代谢通路（map）在不同物种中基因数目的比较，进一步验证了iPath结果。说明牡蛎重金属代谢关键基因家族及通路的显著扩张是牡蛎耐受重金属胁迫的重要原因。 3. MTF-1转录调控机制的研究我们克隆了牡蛎体内的重金属转录因子MTF-1，进行了原核表达、亚细胞定位、凝胶迁移电泳以及RNA干扰分析等。MTF-1基因CDS全长2013bp，编码671个氨基酸。MTF-1基因原核表达的蛋白进行凝胶迁移电泳实验，结果表明该蛋白能够与含有MRE（metal responsive element， TGCRCNC）元件的探针结合，调控下游基因的表达。成功对MTF-1基因进行RNA干扰，干扰效率达75%以上。研究MTF-1干扰后，其调控的下游基因的表达，发现它们在重金属应激下，表达量上升出现滞后且变化幅度减小的现象，说明MTF-1对两个金属硫蛋白基因（metallothionein，MT）和锌转运蛋白1（zinc transporter，ZnT1）均有调控作用。克隆了这两个基因的启动子区域，结果表明MTI基因上游成簇分布着MRE基序，而MTIV基因上游仅存在一个MRE基序，且MTI上游的MRE与MTF-1的结合能力更强。这也解释了MTI在重金属应激下表达量变化更显著的原因。同时对ZnT基因进行了上游序列的克隆分析，结果表明ZnT基因上游存在MRE基序。设计上游MRE探针和MTF-1蛋白进行凝胶迁移电泳实验，结果表明MTF-1可以调控ZnT基因上游MRE基序。 4. ZnT1和MT在重金属应激中联合发挥作用我们对Zn的累积和转运相关基因MTI，MTIV和ZnT1，ZnT2进行了转录水平分析，来阐明牡蛎对重金属Zn的累积转运机制。在应激12 h，牡蛎体内MTI，ZnT1和ZnT2基因均显著上调，最大增加量为对照36，11.9和11.1倍。说明12 h应激条件下，两类基因均发挥了关键的作用。ZnT基因能快速转运Zn起到解毒的作用。而MTI可能在清除氧化胁迫自由基过程中发挥关键作用。在Zn应激26 d，MTI基因表达量增加幅度较小，最高仅为对照1.9倍。而ZnT1和ZnT2则分别增加52和97倍。这个结果表明，ZnT基因在Zn长期累积过程中起到更重要的解毒作用。
语种	中文
公开日期	2014-08-08
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17731]
专题	海洋研究所_海洋生物技术研发中心
推荐引用方式 GB/T 7714	孟杰. 牡蛎重金属胁迫的组学响应及MTF-1转录调控机制研究[D]. 中国科学院研究生院. 2010.