| 题名 | 中国明对虾3种抗菌肽的重组表达与应用的初步研究 |
| 作者 | 邱楚雯 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2013-04 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 王雷 |
| 关键词 | 中国明对虾 抗菌肽 毕赤酵母 重组表达 抑菌 |
| 学位专业 | 水产养殖 |
| 中文摘要 | 目前水产养殖病害问题仍是限制水产养殖业发展的重要障碍之一。当前病害防治主要采用抗生素和化学药物，药物滥用严重破坏环境、影响水产品质量、引发食品安全问题，并最终威胁到人体健康。抗菌肽的抑菌作用具有非特异性，使得病原菌不易产生耐药性，因而作为新型抗菌药物具有潜在应用价值。本文针对中国明对虾3种抗菌肽，研究其重组表达以及抑菌活性，为抗菌肽在水产养殖的应用提供参考。包括以下两部分内容： 1、研究了中国明对虾血蓝蛋白C末端（FcHC-C）的抗菌功能，将血蓝蛋白基因FcHC的2个C末端基因片段连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建酵母表达载体pPIC9K/FcHC-C。该载体经Sal I酶切后，采用PEG法转化毕赤酵母Pichia pastoris GS115。转化子经过PCR鉴定后，阳性克隆通过含有G418的YPD平板筛选，获得高拷贝重组子，并利用甲醇诱导重组毕赤酵母表达目的基因。经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，利用酵母工程菌成功表达了血蓝蛋白C末端片段（rFcHC-C1和rFcHC-C2）。抑菌活性鉴定实验结果显示，重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2作为阴离子抗菌肽具有抗真菌和抗细菌的活性。 2、研究了重组中国明对虾对虾素3-2（rPen3-2）的制备方法及其抑菌性质。利用20L发酵罐高密度发酵生产对虾素3-2，重组毕赤酵母在甲醇诱导时间约为70h时蛋白浓度达到最大值。发酵后的上清液通过不同蛋白纯化方法处理，发现采用疏水层析法未得到目的蛋白，离子交换层析法纯化出的目的蛋白浓度低，而通过镍柱亲和层析方法纯化的重组抗菌肽纯度高。通过研究不同时间、不同浓度的rPen3-2对细菌生长的影响，表明了高浓度rPen3-2对细菌作用效果显著，然而rPen3-2的作用效果还与环境中微生物的生长情况有关。进一步研究rPen3-2对蛋白质合成的影响，结果显示rPen3-2对细菌抑制作用可能是通过抑制细菌体内部分大分子量蛋白质合成来实现的。探讨rPen3-2与抗生素的联合作用效果，发现rPen3-2与青霉素对嗜水气单胞菌的联合作用表现为互不相关；二者对藤黄微球菌的联合作用则表现出拮抗关系。将30mg/L、90mg/L 的rPen3-2加入养殖水体，对水体中菌群数量未造成显著影响。 综上所述，阳离子抗菌肽-对虾素3-2（Pen3-2）和阴离子抗菌肽-血蓝蛋白-C端片段（FcHC-C1和FcHC-C2）均有较好的抑菌活性。重组蛋白rFcHC-C1和rFcHC-C2具有用于动植物病害防治的潜力。抗菌肽rPen3-2的使用需要注意时机和剂量，在细菌生长旺盛时低浓度rPen3-2作用效果不显著，比较适用于预防病害的发生。上述初步研究为抗菌肽的规模化生产与应用提供一定参考，后期还需要进行大量研究工作以优化生产工艺、提高产量和建立合理有效的使用规范。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2014-08-08 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17718]  |
| 专题 | 海洋研究所_海洋生物技术研发中心 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 邱楚雯. 中国明对虾3种抗菌肽的重组表达与应用的初步研究[D]. 中国科学院研究生院. 2013. |
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