| 题名 | 长牡蛎（Crassostrea gigas）Caspase基因克隆、重组与表达分析 |
| 作者 | 李忠肖 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2012-05-18 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 刘保忠 |
| 关键词 | 长牡蛎 Caspase 细胞凋亡 Real time PCR 细胞培养 体外重组表达 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 中文摘要 | 本论文以长牡蛎为研究对象，利用长牡蛎幼虫cDNA文库中的EST信息，克隆到长牡蛎凋亡相关Caspase（CgCASP1），通过Real time PCR分析了该基因在各幼虫阶段的表达特征以及在成体中的组织分布。在原代细胞水平上检测了CgCASP1基因随细胞培养时间增加的表达变化；利用PDTC及H2O2对原代细胞进行刺激诱导凋亡后，分析了CgCASP1和Relish基因mRNA及蛋白水平的表达量变化；构建了体外重组表达载体，并对重组蛋白进行了分离和纯化与活性检测。主要实验的研究结果如下： 利用EST提示信息成功克隆了全长为3613 bp的CgCASP1基因cDNA序列，其中包含473 bp 5’UTR及1526 bp 3’UTR，开放阅读框长1626 bp，编码541个氨基酸。该基因编码的蛋白包含caspase家族经典的保守域P20大亚基和P10小亚基，其中五肽保守序列QACRS突变为QACRG。研究发现了长牡蛎CgCASP1的特有片段，并在cDNA及基因组水平上分别进行了验证；通过real time PCR分析，发现CgCASP1基因在各幼虫时期均有表达，D型幼虫期最高；而成体中鳃的表达量最高，外套膜与肝胰脏中表达量最低。研究发现随着长牡蛎原代细胞培养时间的增加，CgCASP1基因的表达量相应上调；对原代细胞进行H2O2刺激诱导凋亡后Relish基因mRNA表达并无差异，CgCASP1基因表达量显著上调，提示该基因与细胞凋亡相关；PDTC刺激诱导凋亡后下调了Relish基因mRNA表达量，CgCASP1基因没有明显的表达差异；且PDTC刺激后胞质及胞核内的Relish蛋白量均下调，而H2O2刺激后对Relish蛋白无明显作用。在克隆得到CgCASP1基因cDNA全长的基础上，分别构建原核重组表达载体CgCASPl -pEASY-E2和真核重组表达载体CgCASPl- pT7CFE1-Chis进行体外表达：在原核表达系统中得到了约70 kD大小的重组蛋白；在真核表达系统中检测了重组蛋白的活性。 本论文通过对长牡蛎凋亡相关基因CgCASPl基因的克隆，初步分析了该基因的序列特征和与细胞凋亡的相关性，可以为深入了解软体动物凋亡机制，以及个体发育、形态发生及内源性免疫方面增添新的认识。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2014-08-08 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/17761]  |
| 专题 | 海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李忠肖. 长牡蛎（Crassostrea gigas）Caspase基因克隆、重组与表达分析[D]. 中国科学院研究生院. 2012. |
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