| 题名 | 硼酸介导的聚合酶链反应检测5-羟甲基胞嘧啶及应用 |
| 作者 | 赵超 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2013-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | DNA羟甲基化 DNA hydroxymethylation DNA加合物 DNA adducts 生物质谱 Bio-Mass Spectrometry |
| 其他题名 | Boronic Acid-Mediated Polymerase Chain Reaction for Detection of 5-Hydroxymethylcytosine and Its Applications |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 在表观遗传学中，基因序列不发生改变，基因表达却可能发生了变化。其中，DNA甲基化和DNA羟甲基化是两种重要的表观遗传修饰形式，它们的变化都与肿瘤的发展密不可分。研究显示，肿瘤细胞中抑癌基因启动子区CpG岛呈现高甲基化，但是基因组DNA却呈现低甲基化状态。这种甲基化水平的异常变化可见于肿瘤形成的不同时期，因此DNA甲基化可以作为肿瘤等疾病早期诊断的生物标志物。与DNA甲基化相比，DNA羟甲基化含量较低，但具有十分重要的生物学功能。它参与了染色体的重新编程、基因表达的转录调控等过程，并在 DNA 去甲基化过程中发挥重要作用。更为重要的是，多种癌症的产生与5-羟甲基胞嘧啶是相关的，研究显示癌细胞中5-羟甲基胞嘧啶含量要低于正常细胞。 针对DNA羟甲基化检测方法的研究，是本论文的第一部分工作。我们克服了传统限制性内切酶酶解和5-羟甲基胞嘧啶捕获等方法的缺陷，结合葡萄糖基化反应，利用葡萄糖邻位二醇结构与硼酸受体之间的作用抑制Taq DNA聚合酶复制活性，从而发展了一种快速高效、对5-羟甲基胞嘧啶准确识别的检测方法。相关工作的结果如下： 1、采用Real Time-PCR（RT-PCR）实时监测硼酸试剂的加入对葡萄糖基化5-羟甲基胞嘧啶（5ghmC）的识别情况。提出硼酸介导的DNA聚合酶链扩增反应，结合葡萄糖基化反应，可特异性地识别特定基因/片段中的5-羟甲基胞嘧啶。在此基础上发展的5-羟甲基胞嘧啶检测新方法，可应用于各种细胞分析。与传统的限制性内切酶法相比，该方法不受酶切位点限制，可适用于各种序列中5-羟甲基胞嘧啶的分析鉴定。 2、揭示硼酸介导的DNA聚合酶链扩增反应的工作机理，发现硼酸及其衍生物可与5ghmC中的邻二醇发生共价作用，显著增加被复制碱基单元体积，有效抑制聚合酶的扩增反应。 3、筛选出一种可显著抑制DNA聚合酶复制5-羟甲基胞嘧啶活性的硼酸衍生物。 4、对5ghmC进行定量评价结果显示，随着5ghmC含量增加，ΔCt值逐渐增加，PCR扩增产物量逐渐减少，两者呈现线性关系：ΔCt = 6.14 + 4.87 log[5ghmC]，R2 = 0.97。 与DNA羟甲基化不同，DNA加合物是通过引起基因突变而影响基因表达。环境污染物尤其是一些具有亲电性的化学致癌物可以通过与DNA发生共价键合而形成DNA加合物。研究表明DNA加合物并非是随机产生的，不同种类的致癌物都具有不同的选择性攻击对象以及特定的碱基结合位点，这与致癌物本身性质、核苷酸序列情况等因素是紧密相关的。例如，在抑癌基因P53中，基因突变的位点往往位于优先形成DNA加合物的位点，即不同类型致癌物诱发的基因突变谱图与DNA加合物形成模式密切相关。如果产生的DNA加合物持续存在，没有得到及时正确的修复，就会造成不同形式的基因突变甚至是改变基因的表达，因此DNA加合物所引起的基因突变是启动细胞癌变的最主要原因之一。目前，DNA加合物被作为一种重要的生物标志物，广泛应用于具有潜在致癌性污染物的评价和筛选，从而探索癌症发生的诱因。 针对DNA加合物结合位点的研究，是本论文的第二部分工作。传统的DNA酶解测序法，是一种溶液体系内的酶解，酶解速度较难控制、对高分子量酶解产物的质谱响应较差、金属离子干扰严重。我们在核酸外切酶酶解测序的基础上，将酶的固定化技术引入到DNA测序中，设计并合成了基于核酸测序的固定化酶微反应器，可依次降解单链 DNA分子，形成DNA序列梯度；在此基础上，结合先进的生物质谱分析，发展出新颖的单链DNA测序方法。相关工作的结果如下： 1、固定化酶微反应器：反应器具有刚性硅胶骨架结构，其中均匀分布着较大的孔隙结构，使反应器可以保持较低的背压和良好的通透性，有利于酶解液的传输。与溶液体系的酶解相比，反应器内酶活是溶液体系酶活的近14倍，分析表明反应器内部存在着局部高浓度酶的微环境，最终使得反应器酶活有所增加。另外，反应器还具有可反复使用和微量化等优点。 2、酶解测序的定性依据：采用核酸外切酶按照顺序从DNA寡核苷酸链的3’端降解单一核苷酸，控制不同的酶解时间，取出酶解液，进行质谱鉴定，根据相邻质谱峰分子量之差即可以确定序列中各核苷酸分布情况，将不同酶解时间的序列信息进行汇总，即可得到DNA酶解过程中的各个核苷酸片段，达到了DNA测序的目的。同样，如果待测DNA序列中含有修饰位点，也可以通过分子量的差异来进行鉴定分析。 3、金属离子干扰：在反应器制作过程中加入碱性柠檬酸盐，可以有效抑制核苷酸与金属离子形成的复合物，使得谱图清晰、基线平稳，保证了DNA测序过程中每个核苷酸组分的定性鉴定。 4、应用：将反应器酶解测序应用于环境污染物和DNA形成的加合物检测中，以丙烯醛与DNA形成的加合物为例，不但可以检测与DNA损伤相关的优先形成加合物的位点，还可以应用于形成加合物的序列环境特异性分析，可部分解释丙烯醛的致突变机制。 |
| 公开日期 | 2014-07-08 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/7563]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 赵超. 硼酸介导的聚合酶链反应检测5-羟甲基胞嘧啶及应用[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2013. |
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