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题名	纤维素酶与木质纤维素相互作用的定量研究
作者	郑应福
学位类别	博士
答辩日期	2013-05-01
授予单位	中国科学院研究生院
导师	王平
关键词	纤维素酶   木质素   纤维素   相互作用   单组分纤维素酶
其他题名	Quantitative studies of the interactions of cellulase with lignocellulosic
学位专业	生物化工
中文摘要	摘要 木质纤维素生物质在纤维素酶的酶解作用下生成可发酵的葡萄糖等糖类物质是生物燃料炼制过程的关键环节。生物质的天然抗降解屏障严重制约着纤维素酶与纤维素的相互作用。生物质的预处理虽然可以在一定程度上破坏生物质的抗降解屏障，但是预处理之后纤维素的微晶结构以及残留木质素等因素依然影响着纤维素的酶解效率。纤维素酶解过程中纤维素结构的变化，酶解产物的抑制效应，纤维素酶与纤维的相互作用，以及纤维素酶与木质素的相互作用是纤维素酶与木质纤维素相互作用的核心。本论文通过定量研究纤维素酶与木质纤维素的相互作用进而考察影响纤维素酶解效率的内在机制。研究发现： （1）纤维素酶与纤维素的吸附作用是纤维素酶解反应的前提。纤维素酶在纤维素上的吸附随着温度的升高而降低。在不同的温度条件下纤维素酶的Langmuir吸附参数，Pmax和Kd的对数值之间存在较好的线性关系。纤维素的粒径(50-180 ?m)虽然对纤维素酶的吸附有一定的影响，但是其对纤维素酶解效率的影响较小。纤维素的结晶度对纤维素酶吸附和酶解过程影响较大，其中纤维素酶在Avicel上的最大吸附量仅为在PASC上的1/2左右，同时其24-h的酶解效率也为PASC的2/3左右。酶解产物葡萄糖，纤维二糖等以及纤维素酶的活性同样影响着纤维素酶在纤维素上的吸附行为。通过考察纤维素酶在酶解残留物上的吸附和1-h的酶解速率发现纤维素酶在酶解残留物上的吸附量急剧降低，并且导致酶解速率的降低。高浓度的NaCl和LiCl虽然可以增加纤维素酶在纤维素上的吸附量，但是其酶解速率反而有所下降。纤维素酶在纤维素表面的AFM表征发现纤维素酶较为均一的吸附到纤维素的表面。 （2）纤维素酶与纤维素的酶解作用是破解木质纤维素抗降解屏障的核心环节。纤维素酶的热稳定性考察发现纤维素酶中EG的半衰期为54.57 h远低于CBH的81.34 h和?G的98.02 h，致使酶解过程中纤维素酶之间协同效应的降低。定量考察葡萄糖和纤维二糖对纤维素中单组分成分活性的抑制发现：葡萄糖仅对?G的活性有着较大程度的抑制，在20 mg/ml葡萄糖浓度下，其活性仅为10%左右，但是其对EG和CBH的活性抑制较小，仅为5%左右。而纤维二糖不但严重影响着?G的活性而且还造成EG和CBH不同程度的抑制，其中对CBH的抑制效应大于对EG活性的抑制，并且致使纤维素酶协同效应的降低。在Avicel和PASC的酶解体系中进一步证实了纤维二糖的抑制效应大于葡萄糖的抑制效应。在高固体浓度底物的酶解方面，高固体底物的酶解虽然可以提高葡萄糖的浓度，但是酶解效率较低。纤维素粒径(50-180 ?m)以及纤维素酶的浓度对高固体纤维素的酶解效率影响不大。 （3）木质素对纤维素酶的无效吸附和空间位阻效应被认为是影响纤维素酶解效率的主要因素。温度对纤维素酶与木质素吸附作用的影响较大，在4oC的条件下纤维素酶在木质素上1 h就可以达到吸附平衡，但是吸附量仅为在纤维素上的1/15左右；而在50oC的条件下，纤维素酶在木质素上的吸附平衡需要12 h以上，但其吸附量却大大增加，为4oC时的10倍左右，这与木质素和纤维素酶的结构在高温下的变化有关。纤维素酶的吸附参数，Kd，纤维素酶在纤维素和木质素上的吸附动力学以及木质素的含量是分离的木质素影响纤维素酶解效率的主要因素。在分离的木质素和纤维素的混合体系中，纤维素酶在纤维素上的有效吸附f(C)与纤维素的72-h酶解速率有着很好的对应关系。在预处理的玉米秸秆和稻草的体系中木质素的空间位阻效应，H值与酶解效率之间也存在良好的相关性。通过纤维素酶的吸附数据可以分析木质素的无效吸附以及空间位阻效应对纤维素酶解效率的影响。 （4）由于纤维素酶复杂的多酶体系，很难在单组分纤维素酶层次上研究纤维素酶与纤维素之间的相互作用。本研究中采用RPC-HPLC-ESI/MS/MS反相色谱-液质联用的方法并结合生物信息学的计算分析方法首次实现了纤维素酶的单组分成分的一步分离和鉴定。通过在原位状态下研究纤维素酶中单组分成分与木质纤维素相互作用发现：在4oC的情况下，单组分纤维素酶迅速的吸附到纤维素的表面，而CBH的吸附比例要远大于EG的吸附，其中吸附到无定形纤维素PASC上的量最多。在50oC的条件下纤维素酶在酶解反应初期迅速的吸附到纤维素的表面，随着酶解反应的进行，纤维素酶逐渐脱附到酶解体系中。CBH同样是大多数吸附到纤维素的表面，其中由于PASC的酶解速率较快，吸附到PASC上的纤维素酶的释脱附速度最快，而吸附到滤纸上的纤维素酶的释放速率则最慢。
英文摘要	Abstract Lignocellulosic biomass has long been recognized as a major sustainable resource for production of biofuels including bioethanol and other second generation biofuels. Effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass to glucose is one of the crucial processes in the production of bioethanol. However, the effectiveness of this enzymatic hydrolysis is always limited by the recalcitrance of lignocellulosic biomass. In this paper, the interactions of cellulase-cellulose as well as cellulase-lignin were quantitatively studied. The adsorption of cellulase on cellulose is the prerequisite step for cellulose hydrolysis. Cellulase adsorption capacity decreased with temperature increase due to the surface of cellulose changed during hydrolysis process. An obvious linear relation can be found between Ln Pmax and Ln Kd. Cellulase adsorption capability on cellulose with diameter at 50 ?m about 1 fold of that of cellulose with diameter at 180 ?m. However, the hydrolysis yields of cellulose with diameter ranged from 50 to 180 ?m have not much difference. The crystallinity of cellulose, on the contrary, armouphous cellulose, PASC have much more cellulase binding and high hydrolysis yield. High concentration of NaCl and LiCl resuted in more cellulase adsorption on cellulose, but resulted in 72-h hydrolysis yield decrease. Hydrolysis products, glucose, cellobiose, and xylose also decrease cellulase adsorption on cellulose. AFM image characterization of cellulase adsorption on cellulose and found cellulase can bind on cellulose surface uniform. The interactions of cellulase with cellulose are the key step in cellulose hydrolysis process.
语种	中文
公开日期	2014-05-23
页码	148
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/8240]
专题	过程工程研究所_研究所（批量导入）
推荐引用方式 GB/T 7714	郑应福. 纤维素酶与木质纤维素相互作用的定量研究[D]. 中国科学院研究生院. 2013.

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