| 题名 | 杀鱼爱德华氏菌硫胺素转运基因的毒力功能研究 |
| 作者 | 刘昕 |
| 答辩日期 | 2022-05-18 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 中国科学院海洋研究所 |
| 导师 | 孙黎 |
| 关键词 | 杀鱼爱德华氏菌 硫胺素 转运蛋白 环二聚鸟苷单磷酸 毒力 |
| 英文摘要 | 硫胺素（维生素 B1）是焦磷酸硫胺素（Thiamine pyrophosphate，TPP）的前体，是几乎所有生物必需的营养物质。TPP 参与细胞内多种代谢过程，包括糖类、脂质和氨基酸代谢，但其在细菌致病性中的作用尚不清楚。细菌通过自身合成或转运外源硫胺素获得 TPP。环二聚鸟苷单磷酸（c-di-GMP）是细菌的主要第二信使分子，参与调节包括感染在内的多种生物学过程。TPP 可能在c-di-GMP 信号转导中发挥作用，因为它是核糖类生物合成的必需辅酶，而核糖是 c-di-GMP 合成的前体。然而，这种可能性尚无实验证据佐证。杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida）是一种重要的鱼类致病菌，具有广泛的宿主范围。TPP 或 c-di-GMP 在杀鱼爱德华氏菌致病性中的作用有待解析。在本研究中，我们鉴定了一个杀鱼爱德华氏菌硫胺素转运蛋白（Thiamine Transporter，TT）操纵子，该操纵子由 thiB、thiP 和 thiQ 组成，编码一种ThiBPQ 型硫胺素转运系统。敲除 TT 操纵子导致细胞内 TPP 水平显著降低，这表明杀鱼爱德华氏菌可能主要通过摄取硫胺素来获得TPP。TPP 含量降低导致杀鱼爱德华氏菌对大菱鲆的致病性下降，细菌运动能力和宿主细胞黏附能力显著降低，鞭毛和黏附素基因表达显著降低，这表明硫胺素参与了杀鱼爱德华氏菌毒力调控。此外，TPP 含量降低导致细菌胞内 c-di-GMP含量显著下降，而在 TT 突变株中引入外源 c-di-GMP 合成酶则使杀鱼爱德华氏菌恢复了毒力基因的表达、运动能力和宿主细胞黏附能力。综上所述，本研究揭示了硫胺素摄取和 c-di-GMP 在杀鱼爱德华氏菌致病性中的重要作用，为杀鱼爱德华氏菌的防治提供了新的视角。 |
| 语种 | 中文 |
| 目次 | 第一章 绪论.............................................................................................1
1.1 杀鱼爱德华氏菌...............................................................................................1
1.1.1 杀鱼爱德华氏菌概述................................................................................1
1.1.2 杀鱼爱德华氏菌感染过程........................................................................1
1.1.3 杀鱼爱德华氏菌主要毒力因子................................................................2
1.1.4 鱼类爱德华氏菌病的防治........................................................................6
1.2 大菱鲆...............................................................................................................7
1.3 硫胺素...............................................................................................................8
1.3.1 细菌中的硫胺素........................................................................................8
1.3.2 硫胺素对细菌毒力的影响........................................................................9
1.4 c-di-GMP ........................................................................................................10
1.5 本研究的目的和意义.....................................................................................11
第二章 材料和方法 ..............................................................................13
2.1 材料.................................................................................................................13
2.1.1 培养基及抗生素......................................................................................13
2.1.2 实验菌株..................................................................................................13
2.1.3 实验引物..................................................................................................15
2.1.4 实验动物..................................................................................................19
2.1.5 实验试剂..................................................................................................19
2.1.6 实验仪器..................................................................................................21
2.2 方法.................................................................................................................22
2.2.1 生物信息学和序列分析方法..................................................................22
2.2.2 TT 缺失突变株的构建............................................................................22
2.2.3 回补株及过表达菌株构建......................................................................26
2.2.4 报告基因质粒构建..................................................................................29
2.2.5 生长曲线测定..........................................................................................30
2.2.6 体内感染实验..........................................................................................30
2.2.7 大菱鲆外周血淋巴细胞炎症因子转录水平检测..................................31
2.2.8 细菌运动性实验......................................................................................33
2.2.9 鞭毛基因和黏附基因表达检测..............................................................33
2.2.10 PBLs 细胞黏附实验..............................................................................34
2.2.11 荧光强度定量分析................................................................................34
2.2.12 统计分析................................................................................................35
第三章 实验结果与分析 ......................................................................37
3.1 ThiBPQ 蛋白序列比对结果分析 ..................................................................37
3.2 TT 突变株和回补株构建...............................................................................39
3.2.1 TT 上下游同源臂扩增产物及 overlap-PCR..........................................39
3.2.2 同源重组..................................................................................................39
3.2.3 TT 突变株验证........................................................................................40
3.2.4 回补株构建..............................................................................................41
3.3 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌胞内 TPP 的影响..............................................41
3.4 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌生长的影响.......................................................42
3.5 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌毒力的影响.......................................................43
3.6 TT 敲除对大菱鲆外周血淋巴细胞炎症因子表达的影响...........................44
3.7 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌运动能力和鞭毛基因表达的影响...................45
3.7.1 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌运动性的影响............................................45
3.7.2 TT 敲除对鞭毛基因表达的影响............................................................46
3.8 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌黏附宿主细胞能力和黏附基因表达的影响...47
3.8.1 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌黏附宿主细胞能力的影响........................47
3.8.2 TT 敲除对杀鱼爱德华氏菌黏附基因表达的影响................................48
3.8.3 ETAE_1902 和 ETAE_2842 过表达对 ZW1ΔTT 黏附能力的影响 ....49
3.9 c-di-GMP 参与硫胺素摄取对杀鱼爱德华氏菌毒力调控 ...........................50
3.9.1 TT 敲除对胞内 c-di-GMP 相对含量的影响 .........................................50
3.9.2 过表达 adrA 对杀鱼爱德华氏菌鞭毛和黏附基因表达的影响............51
3.9.3 过表达 adrA 对杀鱼爱德华氏菌运动性的影响....................................52
3.9.4 过表达 adrA 对杀鱼爱德华氏菌黏附 PBLs 细胞能力的影响.............53
第四章 讨论...........................................................................................55
第五章 结论与展望 ..............................................................................61
参考文献...................................................................................................63
致 谢.......................................................................................................75
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果......................77
|
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/178300]  |
| 专题 | 中国科学院海洋研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘昕. 杀鱼爱德华氏菌硫胺素转运基因的毒力功能研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学. 2022. |
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