题名 | 基于基因编辑技术探究三角褐指藻的铁代谢机制及其生态效应 |
作者 | 刘雪华 |
答辩日期 | 2021-11 |
文献子类 | 博士 |
授予单位 | 中国科学院大学 |
授予地点 | 中国科学院海洋研究所 |
导师 | 王广策 |
关键词 | 三角褐指藻 铁 细胞密度 叶绿素荧光 形态转变 |
学位名称 | 海洋生物学 |
英文摘要 | 铁元素是海洋浮游植物生长繁殖的限制性因素,也是全球生物地球化学循环和气候变化的重要推动力。硅藻贡献了20%的全球初级生产力(约占海洋初级生产力的40%),极大地影响着海洋生态系统及全球气候。铁元素对硅藻的限制尤甚,在缺铁的环境中硅藻只能发挥其最大初级生产力的60%,所以铁元素在驱动大洋里硅藻种群动态变化中发挥关键作用。由此可见,铁元素可以增加大洋中硅藻的生物量,进而促进大气中的二氧化碳转为有机碳并向深海沉积,以减轻温室效应。 在铁浓度很低的海洋(深远海)环境中,硅藻进化获得了一系列独特的对低铁浓度的响应和调节机制。对此进行深入研究,可以认识大洋中硅藻的生消过程,解析全球的生物地球化学循环规律。为此,本文以海洋模式硅藻——三角褐指藻为研究对象,利用基因编辑技术,研究了硅藻在铁的吸收、转运、储存过程中关键基因的功能,重点关注了藻华爆发过程中细胞密度波动对铁吸收的影响及调控机制,并进一步探究了其生态效应。本文的主要研究结果如下: (1) 揭示了三角褐指藻的细胞密度对负责铁吸收的蛋白——ISIP2a和ISIP1的影响及调控机制。研究结果表明,当三角褐指藻细胞密度从1.6×106 升高至6.4×106 cells/mL时,单个细胞内铁含量下降,但ISIP2a和ISIP1基因的表达量上升。在高细胞密度下沉默ISIP2a,细胞内铁含量显著下降,只有野生型的42.74%,表明ISIP2a可能参与了高细胞密度下三角褐指藻的铁吸收。在细胞培养过程中加入高密度培养的细胞的培养液和浸提液,并没有增加ISIPs的表达,排除了化学因素的调控作用。此外,660–685 nm红光会显著诱导ISIP2a和ISIP1的表达。蓝光激发出的细胞叶绿素荧光强度,与细胞密度及ISIPs的表达量呈正相关。同时,我们进一步设计了“三明治”形式的处理装置以滤除杂散光,保证内层细胞只接收外层细胞发出的叶绿素荧光。结果表明,外层细胞密度的增加显著提高了内层细胞接收到的叶绿素荧光强度以及ISIP2a和ISIP1的转录水平。在种群生态层面,通过构建数学模型计算出大洋中硅藻爆发时叶绿素荧光强度为0.01-1.19 μmol/m2/s。另外,在大洋中来自Tara Ocean的58个站点的原位测量数据和宏转录组数据显示,ISIPs的表达与海水中叶绿素含量也呈正相关。然而,敲除三角褐指藻的红光/远红光受体——光敏色素之后,三角褐指藻ISIPs对于红光的响应依旧存在,说明光敏色素可能没有介导叶绿素荧光对于ISIPs的调控。以上结果表明,随着硅藻爆发时种群密度的升高,细胞间距离降低,细胞可以感知到邻近细胞的叶绿素荧光,从而诱导表达ISIP2a和ISIP1,加速铁吸收。 (2) 比较了低(1.5×106 cells/mL)、中(3×106 cells/mL)、高(6×106 cells/mL)三种细胞密度下,三角褐指藻在白光、蓝光和黑暗条件下的转录组。结果显示,参与铁代谢的基因——ISIP2a,ISIP2b,ZIP9均呈现叶绿素荧光介导的密度依赖的表达模式。加权基因共表达网络分析显示,lightyellow模块的基因与ISIP2a表达模式最为一致,即在白光和蓝光下,基因随着细胞密度的升高表达上调,在黑暗条件下则无显著差异。这一结果说明,叶绿素荧光介导的信号途径对细胞内的生理生化过程有广泛的影响。此外,grey60和darkgrey模块的基因在三种光环境下均呈现密度依赖的表达模式,说明该模块的基因可能受到密度影响的化学信号的调控。利用模块内的基因表达网络鉴定到16个hub gene,在其中发现一个编码Na+/Ca2+渗透通道结构域的基因SLC24A3。该基因(SLC24A3)在模块内互作网络中处于中心位置,说明Ca2+信号可能在响应密度变化的过程中发挥重要作用。 (3) 鉴定到了一个缺铁诱导的新蛋白,Pt_CSP。序列分析结果显示,Pt_CSP与ISIP2b具有同源性,均存在多个铁离子结合位点。Pt_CSP在拟南芥原生质体中定位于囊泡和叶绿体表面。测定了Pt_CSP与其他编码铁饥饿诱导蛋白以及储存蛋白的基因在不同条件下的表达,结果显示Pt_CSP与ISIP2a和ISIP1表达模式相似,均在缺铁、缺硅及高细胞密度条件下被显著诱导表达。利用反向遗传学技术,分别构建了沉默Pt_CSP、ISIP2a和ISIP1的突变株。与WT相比,Pt_CSP-Si、ISIP2a-Si和ISIP1-Si突变株在铁充足条件下生长速度无差异,但是在缺铁条件下,Pt_CSP-Si、ISIP2a-Si和ISIP1-Si沉默株的生长速度、光合参数及细胞壁铁含量均显著下降。基于以上结果,我们认为Pt_CSP在三角褐指藻中具有胞内铁转运的功能。 (4) 探究了三角褐指藻的铁储存蛋白Ferritin与细胞形态转变之间的关系。通过构建三角褐指藻Ferritin过表达和沉默突变株(FTN-OE,FTN-Si),发现FTN-OE突变株由梭形转变为卵圆形,而WT和FTN-Si突变株仍然为梭形。这些FTN-OE卵圆形细胞表现出典型的休眠特征,如生长速率低、适应弱光、硅化的壳面、分泌粘液、上调抗逆性蛋白的表达和硝酸盐储备等。此外,转录组和蛋白质组结果显示,FTN-OE卵圆形细胞在脱落酸(ABA)合成和信号通路上调;利用LC-MS,仅在FTN-OE卵圆形细胞中检测到ABA(2.96 ng/g FW),而在FTN-Si、FTN-OE梭形细胞或WT细胞中均未检测到ABA。以上研究结果表明,三角褐指藻中Ferritin过表达促进了细胞从梭形向卵圆形的转变,之后进入休眠阶段,这一过程伴随着ABA的积累。 综上所述,三角褐指藻的自发叶绿素荧光作为信号不仅诱导ISIP2a和ISIP1的表达,而且影响胞内的诸多生理过程;钙离子通道蛋白SLC24A3可能也参与细胞对种群密度的感知与信号传递;敲降缺铁诱导蛋白Pt_CSP降低了三角褐指藻应对缺铁胁迫的能力;过表达铁储存蛋白Ferritin对三角褐指藻细胞形态及深海碳沉积的影响。 |
语种 | 中文 |
目次 | 目 录 2.2.10 三角褐指藻光敏色素(DPH)敲除株构建... 29 2.3.2 ISIP2a及ISIP1在高细胞密度条件下促进铁吸收... 35 2.3.3 光对ISIP2a和ISIP1表达调控的影响... 38 2.3.5 宏转录组中ISIPs表达量和浮游植物生物量的关系... 45 2.3.6 光敏色素对红光诱导的ISIP2a表达的调控作用... 47 2.4.1 三角褐指藻中铁吸收相关基因的表达受细胞密度的诱导... 49 2.4.2 叶绿素荧光介导了高细胞密度下ISIP2a和ISIP1的调控表达... 50 2.4.4光敏色素(DPH)不介导三角褐指藻对红光响应... 52 3.3.2 差异表达基因的鉴定与qRT-PCR的验证... 59 3.3.5 密度依赖的表达模块的GO和KEGG富集分析... 66 3.4.2 叶绿素荧光对藻细胞响应密度变化的介导... 70 3.4.4 Ca2+信号在响应密度依赖的调节过程中的潜在作用... 72 第4章 敲降缺铁诱导蛋白Pt_CSP对铁吸收、转运过程的影响... 73 4.3.5 Pt_CSP沉默突变株Chla含量测定... 83 4.4.1 Pt_CSP沉默显著影响缺铁条件下三角褐指藻的生长及胞外铁结合... 86 4.4.2 Pt_CSP可能参与缺铁条件下三角褐指藻的胞内铁转运... 87 第5章 过表达铁储存蛋白Ferritin对细胞形态的影响... 89 5.2.8 ABA的提取以及LC-MS的定量分析... 94 5.3.1 三角褐指藻FTN-OE和FTN-Si突变株的构建及形态观察... 94 5.3.2三角褐指藻FTN-OE突变株的生长及光合活性测定... 98 5.4.1 Ferritin过表达伴随着三角褐指藻细胞形态从梭形转化成卵圆形... 107 5.4.2 FTN-OE卵圆形细胞是一种休眠状态... 107 5.4.3 FTN-OE突变株从梭形向卵圆形细胞的转变伴随着ABA的积累... 108 5.4.4 Ferritin积累对促进深海碳沉积具有重要意义... 109 |
内容类型 | 学位论文 |
源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/177045] |
专题 | 海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘雪华. 基于基因编辑技术探究三角褐指藻的铁代谢机制及其生态效应[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学. 2021. |
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