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题名	复合干扰素包涵体折叠复性、分离纯化及稳定性研究
作者	刘永东
学位类别	博士
答辩日期	2007-06-01
授予单位	中国科学院过程工程研究所
授予地点	过程工程研究所
导师	苏志国
关键词	包涵体 蛋白质折叠复性 蛋白质分离纯化 蛋白质稳定性 冷冻干燥
学位专业	生物技术与医学★
中文摘要	本文以复合干扰素为目标蛋白质，对以包涵体形式表达的基因重组细胞因子类蛋白质药物的制备过程进行了详细研究，并对其中涉及的科学原理进行了探索。 实验发现，复合干扰素包涵体在大肠杆菌中是通过分子间二硫键结合所形成的蛋白质聚集体。采用高分辨率的反相高效液相色谱系统对包涵体变性及复性机理进行了详细研究，并对复合干扰素两对二硫键的形成途径进行了确认。变性的复合干扰素包涵体在体外折叠分为两个阶段：第一阶段为Cys29-Cys139形成阶段，第二阶段为Cys1-Cys99形成阶段，其中第二阶段为限速步骤。30小时后复性基本达平衡，此时的复性上清中含多种折叠结构，包括正确折叠的复合干扰素、复性中间体、二聚体及寡聚体，其中正确折叠结构的含量只有50%左右。对复性中间体的研究表明该中间体只含一对二硫键（Cys1-Cys99），光谱分析表明该中间体已经具有类天然结构；但在氧化型电泳中的迁移率较正确折叠结构慢，表明其缺乏紧凑的空间结构，且活性只有正确折叠结构的十分之一。所有结果表明该中间体为一复性过程中的“熔球态”。 实验考察了常用的复性添加剂对复合干扰素复性时聚集沉淀及正确折叠结构的影响，发现只有一定浓度的精氨酸既能有效抑制聚集沉淀又能提高正确折叠结构的含量。在详细研究精氨酸对复合干扰素折叠复性过程影响的基础上提出了新的精氨酸辅助蛋白质折叠机制。详细考察了复性条件对复合干扰素各复性组分的影响，并结合复合干扰素的复性特征对其传统稀释复性工艺进行了有效改进。包涵体溶解时还原剂用量、复性时的pH值、氧化还原体系对复性效果影响显著。复性体系中还原剂过量或pH值过低（<8）时复性停留在中间体，氧化剂过量或pH值过高（>9）可促使中间体转化为可溶寡聚体。复合干扰素复性过程中存在中间体进一步正确氧化与寡聚体形成的竞争，常规的复性方法即使是在最优化的条件下仍只能得到较低的复性收率。改进的稀释复性方法为两段法复性，该方法结合稀释复性与透析操作的特点，使复性分段进行，并且后阶段的复性在一个氧化剂含量逐渐提高的环境下进行。该方法可促使中间体向正确折叠结构转化并有效避免了可溶以及不溶聚集体的生成，使复合干扰素复性收率提高到85%以上。 对复性后蛋白质溶液的纯化不仅要去除所有杂蛋白质，还包括去除非正确折叠的复性结构。实验对比了多种层析方法对复性后复合干扰素纯化精制的效果，阴离子交换层析可去除绝大部分杂蛋白质，但不能去除分子量4万左右的杂带，对可溶寡聚体及中间体无分离效果；阳离子交换和疏水层析可有效去除杂蛋白质及非正确折叠的结构，其中阳离子交换层析的收率大于疏水层析过程。因此实验确定了阳离子交换一步纯化复合干扰素的方法。纯化步骤目标蛋白质的收率为35%，所得复合干扰素在氧化及还原型电泳中均为单带，比活为8×108IU/mg。对纯化后的产品进行末端分析为CDLPQ，与设计的氨基酸序列一致。同时发现复合干扰素纯品中N末端存在超过文献报导的亚型种类，体现出高度不均一现象。 对纯化后的复合干扰素纯品进行了液态稳定性考察。发现液态存放的复合干扰素在酸性和碱性条件下的降解情况并不一样。虽然酸性条件下无寡聚体生成，但单体的含量下降最快，同时活性保留较碱性条件下低。碱性条件下复合干扰素储存会生成二聚和四聚体，随pH增加，四聚体的生成更加明显。通过单体、活性保留及反相高效三种分析手段评价了常用的稳定剂对复合干扰素储存稳定性的影响，并确定了液态存放时非人血清白蛋白的稳定剂配方。 为进一步提高储存稳定性，本论文还对复合干扰素的冷冻干燥过程进行了研究。发现冷冻干燥会造成复合干扰素活性的大量损失。在详细研究冻干条件及稳定剂的影响后，确定了复合干扰素的冻干制剂配方。采用该方法可得到活性大于5×108IU/mg的复合干扰素冻干粉。
语种	中文
公开日期	2013-09-13
页码	166
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/986]
专题	过程工程研究所_研究所（批量导入）
推荐引用方式 GB/T 7714	刘永东. 复合干扰素包涵体折叠复性、分离纯化及稳定性研究[D]. 过程工程研究所. 中国科学院过程工程研究所. 2007.

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