题名两种蝎子多肽的分离纯化及其理化特性研究
作者艾合米丁·外力
答辩日期2019-12-01
授予单位中国科学院大学
授予地点中国科学院新疆理化技术研究所
导师阿布力米提·伊力
关键词蝎子毒素 离子通道多肽 蛋白质提取工艺 蛋白质功能特性 分离纯化
学位名称博士
学位专业有机化学
英文摘要

蝎子是中国传统的动物药材,又名全虫、全蝎。在《中药大辞典》、《本草纲目》和《中国药典》、《维吾尔药志》中均有记载。全蝎已经成为生物活性分子的重要来源,全蝎的主要活性成分有蝎毒、多糖、蛋白质、三甲胺、甜菜碱及核苷类等。全蝎粉、全蝎提取物和蝎毒已被广泛用于治疗气管哮喘、乳腺炎、白血病、肿瘤、癫痫、镇痛、镇静、血中风、面瘫及慢性肾炎等多种疾病,具有良好的临床应用前景。全蝎成分组成复杂,具有多种生物活性。蛋白质是主要活性成分之一。近年来,关于全蝎及蝎毒的研究主要集中在全蝎蛋白药效组分的生物鉴定、脂溶性化学成分的研究以及蝎毒蛋白的分离纯化。蝎子作为一种干旱区的特色生物资源,不但缺乏毒素物质基础系统研究,同时毒素在传统民族药中的应用也缺少生物活性相关的理论依据,因此,本论文以东亚钳蝎和条斑钳蝎为研究对象,开展了蛋白与多肽物质基础研究及其生物活性评价;对东亚钳蝎和条斑钳蝎毒素多肽进行系统的分离纯化以及离子通道活性筛选;采用响应面分析法优化了东亚钳蝎蛋白超声辅助提取最佳工艺条件,建立了蝎子蛋白质部位的制备工艺;利用响应面法优化制备东亚钳蝎抗氧化肽的最佳水解工艺,建立了蝎子抗氧化肽的制备工艺,为干旱区蝎子资源的传统药用和充分利用提供了科学依据。1. 东亚钳蝎毒素多肽的分离制备及其离子通道作用采集新疆吐鲁番地区东亚钳蝎,通过电刺激法收集毒素,对毒素进行初步的前处理和制备冻干粉,采用离子交换树脂层析法、凝胶过滤层析法和反相高效液相色谱法制备了10种单体多肽。对纯度85%以上的6个多肽进行MALDI-TOF/TOF分子量检测,分子量分别为:TQ1, 3782.5 Da;TQ2, 7660.5 Da;TQ3, 4080.2 Da;TQ4, 7147.6 Da;TQ6, 7269.5 Da;TQ10, 7270 Da。利用经典Edman降解法测试多肽TQ2和TQ6的N-端序列,N-端序列分别为:TQ2: NH2-KKNGYAVDSSGKVSECLLNNYCNNICTKVYYATSGYCCLLSCYCFGLDDKAVLKIKDATKSYCDVQIM;TQ6:NH2-VRDAYIAKPHNCVYECARDEYCNDLCTKDGAKVGYCQWVGKYGDGCWCIELVDKIPIRIPGNCH。100 μg/mL浓度的TQ2和TQ6均对DRG细胞上表达的Na+通道无明显作用;随着膜电位的去极化程度的增加,TQ6对DRG细胞上表达的K+通道的抑制作用逐渐减弱,说明TQ6对大鼠背根神经节K+通道有抑制活性,这是电压门控K+通道孔区抑制的典型特征;TQ2能激活大鼠的神经节K+通道;TQ2和TQ6对大鼠背根神经节Ca+通道均有抑制活性。2. 条斑钳蝎毒素多肽成分的分离制备及其离子通道作用采集乌兹别克斯坦的条斑钳蝎,通过电刺激法收集毒素,对毒素进行初步的前处理和制备冻干粉,对凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离制备的两个单体多肽进行MALDI-TOF/TOF分子量检测,分子量分别为:UQ1, 3826.81 Da;UQ3, 6084.67 Da。检测100 μg/mL多肽UQ1和UQ3对大鼠背根神经节(DRG)Na+、K+和Ca2+通道的影响。结果表明: UQ1和UQ3均对大鼠背根神经节K+、Ca2+通道有抑制作用。3. 响应面优化超声辅助提取全蝎蛋白质的工艺及其功能特性研究通过考察0.5 mol/L NaCl溶液、20 mmol/L PBS缓冲液、0.02 mol/L NaOH溶液以及水等不同缓冲液对全蝎蛋白提取率的影响,同时,比较超声提取法和搅拌提取法对得率(%)和蛋白质含量(%)的影响发现0.5 mol/L NaCl缓冲液对蝎子蛋白的提取效果优于其它缓冲液,其得率为14.64%,蛋白质含量为79.06% (质量比,m/m。因此,以蛋白质提取率为响应值,超声辅助0.5 mol/L NaCl提取全蝎蛋白,首先通过单因素实验找出各个影响因素作用范围,再设计出三因素三水平实验,各变量对全蝎蛋白提取工艺的影响大小顺序为超声波功率>提取时间>液固比。运用design-expert响应面法优化超声辅助0.5 mol/L NaCl提取全蝎蛋白质的最佳条件为:超声功率400 W,提取时间60.00 min,液固比18.00 mL/g,在此条件下蛋白含量为78.94%,提取率为24.80%。对优化提取后的全蝎蛋白进行持水性、持油性、乳化能力及乳化稳定性、发泡能力及发泡稳定性等检测。研究结果表明,pH 值为4.0时全蝎蛋白溶解度最低,即为18.75%;在pH 7.0时,持水和持油性分别为40.3 ± 0.28 g/g和27.70 ± 0.14 g/g;并且当浓度为10 mg/mL时,全蝎蛋白乳化性最好,即82.16 ± 0.89%,当浓度为8 mg/mL时,全蝎蛋白发泡性及发泡稳定性及乳化稳定性最好,分别为76.30 ± 0.99%,86.79 ± 0.83 %和85.58 ± 1.10%。超声提取的全蝎蛋白在扫描电子显微镜下呈片状或大片状致密结构,不同微结构可能影响全蝎蛋白的理化性能和功能特性。4. 响应面优化酶解法制备全蝎抗氧化肽的工艺及抗氧化肽的分离制备以全蝎蛋白为研究原料,采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶进行水解。在各种蛋白酶的适宜pH、温度和酶加量条件下水解全蝎蛋白4 h,比较三种蛋白酶水解全蝎蛋白的SDA-PAGE电泳结果、水解度(DH)以及抗氧化活性,木瓜蛋白酶对全蝎蛋白的水解能力优于其它二个酶因此,选用木瓜蛋白酶为目标酶。通过单因素实验,优化加酶量、温度和水解时间,获得制备全蝎抗氧化活性肽的最佳条件:酶加量2.43%(m/m),水解温度45℃和水解时间4.0 h,。在此条件下的最佳水解度和提取率分别为31.31% (m/m)和52.02%。采用超滤膜、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱法,得到了两个新的抗氧化肽,分别命名为P4-1和P4-2,并用HPLC-MALDI-TOF/TOF-MS 鉴定其分子量和氨基酸序列为P4-1: LPTETLH, 810.43 Da;P4-2:IEEDLER, 903.44 Da。当浓度为1.5 mg/mL时,P4-1和P4-2,对ABTS、DPPH和OH自由基清除率分别为83.32 ± 0.81、78.87 ± 0.44和62.96 ± 0.89%;及78.75 ± 0.74、81.22 ± 0.55和58.69 ± 1.09%。

内容类型学位论文
源URL[http://ir.xjipc.cas.cn/handle/365002/7509]  
专题新疆理化技术研究所_资源化学研究室
推荐引用方式
GB/T 7714
艾合米丁·外力. 两种蝎子多肽的分离纯化及其理化特性研究[D]. 中国科学院新疆理化技术研究所. 中国科学院大学. 2019.
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