题名 | 基于核酸适配体构建检测黄曲霉毒素B1 的新型分析方法 |
作者 | 王超
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答辩日期 | 2020-06
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文献子类 | 博士
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授予单位 | 中国科学院生态环境研究中心
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授予地点 | 北京
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导师 | 赵强
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关键词 | 适配体,黄曲霉毒素b1,荧光分析,纳米金,凝血酶,电化学传感, 环境分析,食品安全
Aptamer, Aflatoxin B1, Fluorescence Analysis, Gold Nanoparticles, Thrombin, Electrochemical Sensor, Environmental Analysis, Food Safety
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学位名称 | 理学博士
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其他题名 | Development of New Methods for Aflatoxin B1 Detection Using Aptamers
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学位专业 | 环境科学
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英文摘要 | 黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是最常见和毒性最强的一种天然真菌毒素,在自然界中分布广泛,严重危害人类健康。世界卫生组织癌症研究机构已将AFB1 列为一类致癌物质。AFB1 检测的传统方法,如高效液相色谱法和液相色谱-质谱法,往往需要昂贵仪器设备和耗时的样品前处理过程等,在快速分析方面仍有局限。虽然免疫分析方法可以简化操作步骤,但是免疫分析方法需要使用制备过程复杂、成本高、容易变性的抗体作为目标物识别单元。
核酸适配体,简称适配体,具有许多抗体所不具备的优点,比如靶标物范围广、亲和力高、分子量小、热稳定性高、成本低、容易化学合成和修饰等。在本论文中,我们针对快速检测AFB1 的需求,开发了一系列能够方便快速地检测AFB1 的新型适配体分析方法,包括:
(1)荧光适配体分子信标分析方法。AFB1-适配体结合作用能诱导适配体形成茎-环(发夹)构象,导致被标记在适配体两端的荧光基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)相互靠近,产生荧光淬灭现象。该方法具有简便、快速、不需样品分离的优点。
(2)基于非标记适配体结构转换的荧光检测方法。当AFB1 不存在时,两条互补链DNA(FDNA 和QDNA)能同时与适配体杂交,形成一个双链结构的DNA 组装分子,标记在FDNA 上的FAM 与标记在QDNA 上的BHQ1 相邻近,发生荧光淬灭。当加入AFB1 后,适配体与AFB1 结合,导致QDNA 从该DNA组装分子上解离,BHQ1 远离FAM,荧光强度恢复。该方法使用的适配体无需标记,保护了适配体原有的亲和特性。该方法是一种信号增加型的检测方法,灵敏度高,可检测的最低AFB1 浓度为16 pM。
(3)基于纳米金颗粒(GNP)淬灭作用的荧光检测方法。无AFB1 时,FAM标记的适配体探针与固定在GNP 上的互补链DNA(cDNA)杂交,导致FAM靠近GNP 表面,发生荧光淬灭。当AFB1 存在时,适配体与AFB1 结合,而不与GNP 上的cDNA 杂交,标记在适配体末端的FAM 远离GNP,荧光强度增加。通过测量FAM 荧光强度的大小可实现AFB1 检测。该方法的荧光淬灭效率高,灵敏度高,可检测的最低AFB1 浓度为61 pM。
(4)凝血酶联适配体分析方法。凝血酶通过一个双功能的适配体标记在偶联物BSA-AFB1 包被的微孔板上,然后催化多肽底物水解,产生检测信号。若存在AFB1,凝血酶联适配体与游离的AFB1 结合,导致微孔板上的凝血酶数量减少,信号下降。该方法利用了凝血酶的高效催化活性,以及适配体的高亲和力和高特异性。
(5)信号上升型电化学传感方法。没有AFB1 时,固定在金电极上的适配体能与其cDNA 杂交,导致标记在适配体末端的电化学活性基团(亚甲基蓝,MB)远离电极表面,电流信号小。加入AFB1 后,AFB1-适配体结合作用使适配体呈发夹结构,导致MB 靠近电极表面,电流信号增大。该电化学适配体传感器制作简单、响应迅速、可再生、成本低。
(6)信号下降模式的电化学适配体传感器。没有AFB1 时,cDNA 修饰的金电极能够捕获MB 标记的适配体,导致MB 基团接近电极表面,电流信号高。当AFB1 存在时,MB 标记的适配体倾向于与AFB1 结合形成适配体-AFB1 复合物,而不被电极捕获,电流信号降低。该方法使用的适配体只需用MB 单标记,相对简单、成本低。另外,该方法对适配体的构象变化无具体要求,设计策略通用。 |
页码 | 146
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内容类型 | 学位论文
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源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/43657] |
专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室
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推荐引用方式 GB/T 7714 |
王超. 基于核酸适配体构建检测黄曲霉毒素B1 的新型分析方法[D]. 北京. 中国科学院生态环境研究中心. 2020.
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