题名基于核酸适配体构建检测黄曲霉毒素B1 的新型分析方法
作者王超
答辩日期2020-06
文献子类博士
授予单位中国科学院生态环境研究中心
授予地点北京
导师赵强
关键词适配体,黄曲霉毒素b1,荧光分析,纳米金,凝血酶,电化学传感, 环境分析,食品安全 Aptamer, Aflatoxin B1, Fluorescence Analysis, Gold Nanoparticles, Thrombin, Electrochemical Sensor, Environmental Analysis, Food Safety
学位名称理学博士
其他题名Development of New Methods for Aflatoxin B1 Detection Using Aptamers
学位专业环境科学
英文摘要

       黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是最常见和毒性最强的一种天然真菌毒素,在自然界中分布广泛,严重危害人类健康。世界卫生组织癌症研究机构已将AFB1 列为一类致癌物质。AFB1 检测的传统方法,如高效液相色谱法和液相色谱-质谱法,往往需要昂贵仪器设备和耗时的样品前处理过程等,在快速分析方面仍有局限。虽然免疫分析方法可以简化操作步骤,但是免疫分析方法需要使用制备过程复杂、成本高、容易变性的抗体作为目标物识别单元。
      核酸适配体,简称适配体,具有许多抗体所不具备的优点,比如靶标物范围广、亲和力高、分子量小、热稳定性高、成本低、容易化学合成和修饰等。在本论文中,我们针对快速检测AFB1 的需求,开发了一系列能够方便快速地检测AFB1 的新型适配体分析方法,包括:
      (1)荧光适配体分子信标分析方法。AFB1-适配体结合作用能诱导适配体形成茎-环(发夹)构象,导致被标记在适配体两端的荧光基团(FAM)和淬灭基团(BHQ1)相互靠近,产生荧光淬灭现象。该方法具有简便、快速、不需样品分离的优点。
      (2)基于非标记适配体结构转换的荧光检测方法。当AFB1 不存在时,两条互补链DNA(FDNA 和QDNA)能同时与适配体杂交,形成一个双链结构的DNA 组装分子,标记在FDNA 上的FAM 与标记在QDNA 上的BHQ1 相邻近,发生荧光淬灭。当加入AFB1 后,适配体与AFB1 结合,导致QDNA 从该DNA组装分子上解离,BHQ1 远离FAM,荧光强度恢复。该方法使用的适配体无需标记,保护了适配体原有的亲和特性。该方法是一种信号增加型的检测方法,灵敏度高,可检测的最低AFB1 浓度为16 pM。
      (3)基于纳米金颗粒(GNP)淬灭作用的荧光检测方法。无AFB1 时,FAM标记的适配体探针与固定在GNP 上的互补链DNA(cDNA)杂交,导致FAM靠近GNP 表面,发生荧光淬灭。当AFB1 存在时,适配体与AFB1 结合,而不与GNP 上的cDNA 杂交,标记在适配体末端的FAM 远离GNP,荧光强度增加。通过测量FAM 荧光强度的大小可实现AFB1 检测。该方法的荧光淬灭效率高,灵敏度高,可检测的最低AFB1 浓度为61 pM。
      (4)凝血酶联适配体分析方法。凝血酶通过一个双功能的适配体标记在偶联物BSA-AFB1 包被的微孔板上,然后催化多肽底物水解,产生检测信号。若存在AFB1,凝血酶联适配体与游离的AFB1 结合,导致微孔板上的凝血酶数量减少,信号下降。该方法利用了凝血酶的高效催化活性,以及适配体的高亲和力和高特异性。
      (5)信号上升型电化学传感方法。没有AFB1 时,固定在金电极上的适配体能与其cDNA 杂交,导致标记在适配体末端的电化学活性基团(亚甲基蓝,MB)远离电极表面,电流信号小。加入AFB1 后,AFB1-适配体结合作用使适配体呈发夹结构,导致MB 靠近电极表面,电流信号增大。该电化学适配体传感器制作简单、响应迅速、可再生、成本低。
      (6)信号下降模式的电化学适配体传感器。没有AFB1 时,cDNA 修饰的金电极能够捕获MB 标记的适配体,导致MB 基团接近电极表面,电流信号高。当AFB1 存在时,MB 标记的适配体倾向于与AFB1 结合形成适配体-AFB1 复合物,而不被电极捕获,电流信号降低。该方法使用的适配体只需用MB 单标记,相对简单、成本低。另外,该方法对适配体的构象变化无具体要求,设计策略通用。

页码146
内容类型学位论文
源URL[http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/43657]  
专题生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室
推荐引用方式
GB/T 7714
王超. 基于核酸适配体构建检测黄曲霉毒素B1 的新型分析方法[D]. 北京. 中国科学院生态环境研究中心. 2020.
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