人类隐花色素蛋白(Homo sapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与 FAD结合状态的 N MR研究

	人类隐花色素蛋白(Homo sapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与 FAD结合状态的 N MR研究
	王晓明 2; 王嘉榕 2; 李燕 2; 王玉娟 2
刊名	中国科学技术大学学报
	2014
卷号	44
关键词	人类隐花色素(CRY)蛋白突变蛋白黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 杆状病毒-昆虫表达系统
ISSN号	0253-2778
其他题名	Expression of HsCRY in insect cells and research into its binding state with FAD by NMR
英文摘要	隐花色素(Cryptochrome,CRY)蛋白是一种对蓝光敏感的蛋白,它与辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)形成的自由基电子对在调节生物钟及感应磁场中发挥重要的作用,但目前对人类CRY(Homo sapiens CRY,HsCRY)蛋白的结构功能研究尚未见报道.以HeLa细胞RNA为模板,通过RT‐PCR方法扩增得到全长1761 bp的 H sCRY1基因,把其克隆到HTA杆状病毒转座载体上,经菌落PCR和测序鉴定出阳性重组转座载体HTA‐HsCRY1,转化含有病毒杆粒bacmid 的 D H10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选和 PCR 检测获得重组质粒 Bacmid‐HsCRY1,转染昆虫 Spodoptera f rugiperda(sf9)细胞,产生的病毒感染昆虫细胞获得分子量为66kDa的目的蛋白HsCRY1.蛋白经Western Blot和SDS‐PAGE鉴定,并利用镍亲和层析柱纯化,结果100 mmol/L及200 mmol/L咪唑均可洗脱下较纯的目标蛋白.同源蛋白的多序列比对表明HsCRY1的W320,W374以及 W397可能组成传递电子的色氨酸三联体,对3个突变蛋白W320F,W374F以及W397F进行表达纯化.~(31)P核磁共振检测蛋白与辅因子FAD的结合状态,发现与自由态FAD的磷谱相比,野生型HsCRY1及突变体3(W397F)结合的FAD的化学位移发生了改变,而HsCRY1突变体1(W320F)以及突变体2(W374F)不结合FAD.本实验成功构建了表达HsCRY1蛋白及其色氨酸突变蛋白的杆状病毒‐昆虫表达系统,并通过核磁共振的方法发现色氨酸突变位点会对蛋白与FAD的结合产生影响.
语种	中文
CSCD记录号	CSCD:5299011
内容类型	期刊论文
源URL	[http://ir.hfcas.ac.cn:8080/handle/334002/96002]
专题	中国科学院合肥物质科学研究院
作者单位	1.中国科学院合肥物质科学研究院,强磁场科学中心 2.中国科学院合肥物质科学研究院,强磁场科学中心 3.中国科学院合肥物质科学研究院,强磁场科学中心 4.中国科学院合肥物质科学研究院,强磁场科学中心
推荐引用方式 GB/T 7714	王晓明,王嘉榕,李燕,等. 人类隐花色素蛋白(Homo sapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与 FAD结合状态的 N MR研究[J]. 中国科学技术大学学报,2014,44.
APA	王晓明,王嘉榕,李燕,&王玉娟.(2014).人类隐花色素蛋白(Homo sapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与 FAD结合状态的 N MR研究.中国科学技术大学学报,44.
MLA	王晓明,et al."人类隐花色素蛋白(Homo sapiens Cryptochrome,HsCRY)昆虫表达系统的建立及其与 FAD结合状态的 N MR研究".中国科学技术大学学报 44(2014).