| 题名 | 扩展青霉碱性脂肪酶的结构生物学研究及蛋白质结构解析方法探索 |
| 作者 | 卞传兵 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2007-06-04 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | 扩展青霉碱性脂肪酶 X-射线 结构解析 相角 非晶体学对称性 |
| 其他题名 | Structural study of Penicillium expansum lipase and Research on Protein Phase Determination |
| 学位专业 | 物理化学（含：化学物理） |
| 中文摘要 | 本文总结了本人在扩展青霉碱性脂肪酶（PEL）的表达、纯化、结晶、数据收集及晶体结构解析的工作。并在此基础上对几种常用的蛋白质结构相角测定方法进行了探索和讨论。其主要的工作内容和结果归纳如下： 1． PEL的表达、纯化与结晶 实现了PEL基因在毕赤酵母中的高效表达。表达蛋白PEL-GS分泌至培养基中，分子量约28kD，与PEL大小相近，占分泌蛋白的95%。用不添加YNB、生物素及初始pH7.0的培养基，每24h添加1.5%甲醇诱导，进行重组酵母培养，培养72h发酵液酶活达260 U/ml。发酵上清液，经硫酸铵沉淀、DE52离子交换纤维素柱层析,MonoQ阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤进行纯化。得到适合晶体生长的高纯度蛋白质。并利用座滴汽相扩散法，得到适合X－射线衍射的晶体。 2． PEL的X－射线衍射数据收集 分别在室内光源及同步辐射光源对PEL晶体进行数据收集。并分别得到最大分辨率为2.3Å及1.3Å的衍射数据。晶体晶格为四方格子，通过计算确定属于空间群P43212或P41212，晶胞参数为a = 88.09 Å, b = 88.09 Å, c = 126.54 Å。计算得到非对称单元内有两个PEL分子。 同时，为结构解析的需要，分别收集到多套含有Pt, Hg等重原子的PEL衍生物数据、Br－PEL的多波长散射数据以及S单波长反常散射数据，并对分别利用室内Cu靶、Cr靶光源及同步辐射收集硫反常散射数据进行了探索。 3． PEL结构解析研究 PEL与模型的低同源性以及其结构的特殊性，决定了PEL结构解析的困难。分别利用分子取代法，同晶置换法及多（单）波长反常散射法对PEL的结构解析进行了研究。通过大量的尝试，利用S单波长反常散射法及NCS电子密度平均法，结合溶剂平整技术，对PEL电子密度循环修正和提高，最终得到PEL的大部分相角信息。本文大部分的工作是对PEL相角测定的研究与探索。 4． Se-MET PEL在毕赤酵母中的表达、纯化及结晶 成功地在毕赤酵母中表达了PEL的硒代衍生物蛋白质，即硒代甲硫氨酸PEL。经过纯化和活性测定，获得了0.5 mg可用于晶体生长的Se－MET PEL，利用座滴汽相扩散法，最终得到了几十颗适合于X－射线衍射的晶体。与野生型PEL相比较，晶体的晶型有了一些变化，晶体质量有所提高。并将在APS同步辐射进行反常散射数据的收集。 5． PEL P163A突变体的表达、纯化及结晶 利用与PEL相同的实验方法，对其P163A突变体进行表达、纯化，得到10mg蛋白质用于晶体生长。并确定了晶体生长的条件，经过对晶体条件的优化，晶型由原来的成簇针状晶体提高到片状晶体。 6. 尿激酶受体（suPAR）的亲和层析纯化策略。 利用suPAR与其配体（尿激酶）之间的强结合力，使用尿激酶亲和柱对suPAR进行纯化.得到了一套行之有效的suPAR单体的纯化策略。为尿激酶受体系统的结构研究奠定了基础。 7. 小G蛋白Sar1M-GDP的晶体结构解析。 利用分子取代法确定最初的结构相位信息，继而经过CNS修正程序，O模型构建程序对Sar1GTPase及其突变体进行了结构解析。为更好地解释COPII装配和去装配机制提供了依据。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 141 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7954]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 卞传兵. 扩展青霉碱性脂肪酶的结构生物学研究及蛋白质结构解析方法探索[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2007. |
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