| 题名 | 小G蛋白Sar1 GTPase及其突变体的克隆、表达、纯化、结晶和结构解析(Cloning, Expression, Purification and Crystallization of Sar1& Sar1 Mutants, and Structures Analysis) |
| 作者 | 饶义剑 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2006-04-25 |
| 授予单位 | 中国科学院福建物质结构研究所 |
| 授予地点 | 福建物质结构研究所 |
| 导师 | 黄明东 |
| 关键词 | Sar1 晶体结构 COP II转配 COPII去装配 二聚化 switch I switch II |
| 学位专业 | 物理化学(含：化学物理) |
| 中文摘要 | 在真核细胞中，介导从内质网(Endoplasmic reticulum)到高尔基体(Gogli)的物质运输过程是由一系列囊泡（Vesicle）所完成。囊泡的形成可以说是衣壳蛋白（coat protein）们通力合作的成果：衣壳蛋白捕获了货物蛋白（cargo protein），并诱导膜的弯曲（curvature）。分泌型蛋白质通过COPII(coat protein complexes)囊泡实现了从内质网到高尔基体的转运过程；COPⅡ是多亚基的蛋白复合物, 构成的亚基有Sec23/Sec24和Sec13/Sec31等。 COPⅡ囊泡在ER上装配需要一种称为Sar1的小G蛋白的参与并调节。当Sar1在鸟苷酸交换因子(GEF:guanine nucleotide exchange factor)Sec12参与下GDP与GTP进行了交换,与激活蛋白(GAP: GTPase-activating proteins）Sec23作用，诱导Sec23和Sec24蛋白的结合,接着是Sec13和Sec31蛋白的结合。Sec23/Sec24复合物和Sec13/Sec31复合物相互作用,装配成一个在ER表面的大蛋白质复合物,并从ER表面脱离形成完整的小囊泡。Sar1-GTP在具有GAP活性的Sec23 作用下发生水解，进而使囊泡从内质网中脱离出来。Sar1 GTPase作为一个“分子开关”控制蛋白质与蛋白质，以及蛋白质与脂质之间的相互作用，并指导它们从内质网中分泌出来。本实验的目的是通过结晶学的方法得到Sar1-GDP及Sar1[H79G]-GDP突变体蛋白质的三维结构进而解析Sar1在生命过程中的作用机理。 1. Sar1[H79G]-GDP的晶体结构 Sar1作为一个小GTP酶，调控COPII的分泌过程，以前的实验证明Sar1[H79G]（或表示为Sar1H79G）突变体能够降低激活蛋白因子Sec23/24复合物所引起的Sar1GTPase水解反应速率，使Sar1GTPase大量地以GTP的状态形式存在稳定COPⅡ囊泡装配过程而抑制它的去装配过程。在本实验中，我们通过结晶学方法解析了2.5 Å的Sar1[H79G]-GDP复合物的晶体结构(已存放在PDB数据库中，code: 2FA9)。与野生型Sar1-GDP的晶体结构一样，它是一个二聚体复合物(定义为Mol A和Mol B)。相比于野生型Sar1-GDP的晶体结构，Sar1[H79G-GDP]在分子开关II区域(switch II)，特别是与79位甘氨酸(在野生型为组氨酸)相邻的氨基酸有着很大的构象变化。从晶体结构可以清楚地看出Sar1蛋白质79位氨基酸的突变失去了His79与之相邻水分子的氢键相互作用，断开了His79-GTP-Sec23之间的盐桥相互作用，进而降低GTP的水解反应速率。我们的结果从晶体学上证明了分子开关II区域(switch II)在COPⅡ囊泡去装配过程中起到很重要的作用。 2. 低镁离子浓度下的Sar1-GDP晶体结构及COPII的装配机制 小G蛋白存在着GDP结合的非活性态和GTP结合的活性态，GDP/GTP的相互转化一般由鸟苷酸交换因子(GEF)和激活蛋白(GAP)调控。这两种活性形式之间的转换使他们能够发挥一种类似“分子开关”的作用。Sar1属小G蛋白Ras超家族成员，它与所有小G蛋白一样都有两个“分子开关”结构域，即“分子开关 I”(switch I)和“分子开关 II(switch II)”。广泛的结构研究表明小G蛋白在GDP结合态和GTP结合态的两种状态下，“分子开关”结构域的构象有很大的变化。晶体学研究发现小G蛋白的鸟苷酸交换因子诱导GDP/GTP交换通过瞬间打乱小G蛋白的核苷酸结合口袋里Mg2+的配位，使核苷酸从结合口袋里脱离出来，并以稳定的阴离子中间态存在，GTP和Mg2+在GEF的参与下完成GDP/GTP的交换。Mg2+不仅是小G蛋白的必要辅因子，同时也是其他G蛋白的辅因子。对于Ras小G蛋白在失在Mg2+的情况下，它与GDP或是GTP的结合力降低了至少500倍(1-3)。一般而言，Mg2+以八面体配位的形式存在，它与小G蛋白的亲和力一般在纳摩尔到微摩尔数量级。到目前为止，已经成功地解析了许多GDP结合态和GTP结合态的小G蛋白晶体结构，对于这两种结合态的结构不同之处能够很直观的对比。然而，对于没有结合Mg2+的小G蛋白晶体结构却很少报道。我们以前报道了结合有Mg2+的Sar1-GDP晶体结构。在本实验中，我们利用巧妙而简单的方法得到了在低Mg2+浓度下的Sar1-GDP晶体结构(以后以Sar1M-GDP表示)。与野生型的晶体结构一样，Sar1M-GDP也是一个二聚体(定义为 Mol A 和Mol B)，然而，从电子密度图上看在Mol A并没有发现Mg2+，而在Mol B却可以观测到与野生型Sar1-GDP具有相同位置的Mg2+。由于Mg2+在Mol A的核苷酸结合口袋的缺失， Sar1M-GDP晶体结构相对于野生型的而言，Mol A的switch I结构域的构象发生了很大的变化，呈一个打开状态。而这个结构上的变化与Ha-Ras-Sos (Sos是Ras的鸟苷酸交换因子)复合物中Ha-Ras的结构变化相似。这个Sar1M-GDP晶体结构揭示了Mg2+在GDP/GTP交换过程中所扮演的重要调节作用，我们认为对于Sar1, 鸟苷酸交换因子Sec12可能就是利用这个Switch I的内在性质来完成GDP/GTP的交换。通过和其他的小G蛋白晶体结构相比较，我们认为Sar1M-GDP的二聚体化作用与其生物学功能是相关的。为此，对于Sar1小G蛋白，我们提出一个“分步的GDP/GTP交换模型”，即GDP/GTP在Sar1上的交换是先从Mol A开始而后是Mol B。这个模型可以很好地解释为什么在COPII的装配和去装配的过程中“前衣被复合物”(prebudding complex)可以在GEP和GAP同时有的情况下可以动力学上稳定地存在。从而很好的解释在COPII的装配和去装配过程中最矛盾的问题。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-05-09 |
| 页码 | 77 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.fjirsm.ac.cn/handle/350002/7876]  |
| 专题 | 福建物质结构研究所_中科院福建物质结构研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 饶义剑. 小G蛋白Sar1 GTPase及其突变体的克隆、表达、纯化、结晶和结构解析(Cloning, Expression, Purification and Crystallization of Sar1& Sar1 Mutants, and Structures Analysis)[D]. 福建物质结构研究所. 中国科学院福建物质结构研究所. 2006. |
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