随着化石能源的日益枯竭，利用生物发酵法生产生物燃料逐渐受到人们的重视。丁醇具有良好的燃烧性能，其能量密度接近汽油，能够以任意比例与汽油混合，因此与其他生物燃料如乙醇等相比，更适合作为液体燃料。而发酵原料和菌株生产能力一直是困扰生物丁醇工业化生产的瓶颈问题。本文以木糖渣为原料，利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变所得的高产拜氏梭菌Y-3为发酵菌株，对木糖渣预处理、纤维素酶酶解工艺及木糖渣水解液的丁醇发酵等方面进行了研究；另外，纯化得到了产溶剂梭菌丁醇合成途径中关键酶丁酰辅酶A脱氢酶复合体，并对其酶学性质进行了初步研究。

首先，使用不同的方法对木糖渣进行预处理，分析处理前后木糖渣的组成变化并比较了糖化效果。使用氢氧化钠预处理后，木糖渣中纤维素含量由67.2 %提升至92.5 %，酶解后纤维素转化率达到76.3 %。氢氧化钙脱毒预处理后，木糖渣的木质纤维素组成并未明显改变，但酶解后纤维素转化率为71.5 %，高于对照组38.1 %的纤维素转化率；通过对其抑制物组成分析发现，氢氧化钙脱毒工艺去除了木糖渣中38.8 %乙酰丙酸、66.2 %香草醛、100 %乙酸、98.4 %糠醛、96.0 %羧甲基糠醛和31.9 %阿魏酸，这些化合物对纤维素酶活性及丁醇发酵有抑制作用。

其次，对拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）NCIMB 8052进行EMS诱变，通过淀粉和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选培养基的多次筛选，获得了一株高产菌株Y-3，丁醇和ABE产量在发酵96 h后达到9.4 g/L和15.8 g/L，分别比出发菌株提高了40.3 %和30.6 %。使用未处理木糖渣水解液（还原糖含量25.0 g/L）进行发酵，96 h后，该突变菌株仅产生3.8 g/L ABE，推测由于未处理木糖渣水解液中还原糖含量不足或含有的抑制因子造成。氢氧化钠处理木糖渣水解液的还原糖含量增至60.4 g/L，但其中存在的抑制因子延长发酵时间至144 h，丁醇和ABE产量为8.2 g/L和16.0 g/L。氢氧化钙脱毒处理木糖渣水解液的还原糖含量为49.3 g/L，丁醇和ABE产量在发酵96 h后分别达到5.6 g/L和9.9 g/L；补充水解液糖量至60 g/L后，在发酵48 h后，丁醇和ABE产量分别为 8.2 g/L和16.0 g/L，表明影响该水解液ABE发酵的主要因素是培养基中较低的葡萄糖浓度。

另外，本试验利用离子交换层析和凝胶过滤层析从丙酮丁醇梭菌中纯化得到了Bcd/EtfAB酶复合物，该酶复合物由丁酰-CoA脱氢酶和电子传递体EtfA和EtfB组成，SDS-PAGE显示分子量分别为41、36和28KD。酶活检测发现，由Bcd/EtfAB酶复合物催化的巴豆酰-CoA向丁酰-CoA的转化，耦合了NADH的氧化及Fd的还原，比酶活为0.4 U/mg（NADH氧化反应）；另外，Bcd/EtfAB酶复合物可以催化TTC（triphenyltetrazolium chloride，含有两个电子的人工电子受体）的还原反应及二茂铁六氟磷酸（ferrocenium hexafluorophosphate，含有一个电子的人工电子受体）的还原反应，比酶活分别为0.35 U/mg和0.14 U/mg。同时，在丙酮丁醇梭菌中首次发现Bcd/EtfAB酶复合物可以催化NAD+的还原反应，并且该反应与Fd的氧化相耦合，比酶活为0.13 U/mg，但未涉及丁酰-CoA的氧化。

Due to the increasing price of gasoline and the depletion of fossil fuel reserves, biofuel productions by bio-fermentation have been attracting more and more attention. As a renewable energy carrier, biobutanol has many chemical and physical features that are particularly attractive for application as a biofuel compared with ethanol, including similar energy content with gasoline and higher than that of ethanol, and capability of blending with gasoline fuel at any ratio without the necessity for modification of vehicle engines. Nevertheless, the key problems associated with the bioproduction of butanol are the high substrate cost and low product yield. In this paper, biobutanol production from corncob residue using the mutant Clostridium beijerinckii Y-3 was studied, including pretreatment of corncob residue, cellulase hydrolysis for lignocellulose and butanol fermentation using the hydrolysate from corncob residue. Furthermore, butyryl-CoA dehydrogenase / electron transfer flavoprotein complex from butanol-synthesing clostridia was purified and characterized, in order to explore its function in the biosynthesis pathway of butanol.

First of all, the studies were focused on different ways of pretreatment and cellulase hydrolysis for corncob residues. NaOH pretreatment got a high degree of delignification, 92.5% cellulose obtained and 0.2% lignin remained, indicating that the lignin structure of corncob residue was broken down, and cellulose conversion ratio of NaOH pretreated corncob residue after cellulase hydrolysis reached 76.3%. The composition of Ca(OH)2-detoxified corncob residue was similar with that of the untreated, suggesting Ca(OH)2 detoxification did not have the effects of changing the structure of corncob residue, but cellulose conversion ratio of Ca(OH)2-detoxified corncob residue after cellulase hydrolysis achieved 71.5 %, much higher than that obtained from the untreated, 38.1 %. From the results of HPLC analysis, we found that there are some inhibitors existing in the untreated corncob residue. And it was determined that, in Ca(OH)2-detoxified corncob residue, the inhibitors were removed partly, including 38.8% levulinic acid, 66.2% vanillin and 100% acetic acid, which inhibit cellulases activities, and 98.4% furfural, 96.0% HMF, 66.2% vanillin and 31.9% ferulic acid, which inhibit growth and fermentation of clostridia.

Secondly, researches on improving the ability of butanol production for butanol-synthesizing clostridia were studied. C. beijerinckii NCIMB 8052，an anaerobic butanol producing strain，was mutated by EMS．One high yield mutant strain Y-3 was isolated by starch and 2-deoxy-D-glucose plates. The results showed that the yield of total solvent and butanol produced from Y-3 were 15.8 g/L and 9.4 g/L, which were 30.6 % and 40.3 % higher than those produced from the original strain in the glucose mediun．Using the hydrolysate of untreated corncob residue as the substrate for ABE fermentation, the final concentration of ABE was only 3.8 g/L. The low concentration of ABE was likely caused by two problems: the low cellulase digestibility and weak sugar utilization. It was found that the reducing sugars content of NaOH pretreated corncob residue hydrolysate increased to 60.4 g/L, but during the fermentation of the hydrolysate the cultures did not grow until 72 h post inoculation, and the fermentation time was prolonged to 144 h, which was likely due to inhibitors produced during the process of NaOH pretreatment. The ABE production profiles of C. beijerinckii Y-3 using Ca(OH)2-detoxified corncob residue hydrolysate, over the course of 96 h, showed that the culture produced 5.6 g L-1 of butanol and 9.9 g L-1 of total ABE. Fermentation of Ca(OH)2-detoxified corncob residue hydrolysate supplemented with 10 g L-1 glucose increased the butanol production, and resulted in the yield of total ABE and butanol of 16.3 g/L and 8.8 g/L, respectively. The comparison of of Ca(OH)2-detoxified corncob residue hydrolysate with and without supplemented sugar indicated limited glucose yield was the main reason of low ABE content in the fermentation of LCRH, which further explained that the corncob residue after Ca(OH)2 detoxification could be used as the substrate for butanol production.

The intracellular Bcd/EtfAB complex from C. acetobutylicum ATCC 824 was purified by ultrasonic cell disruption, ion exchange chromatography and gel filtration, which composed of three subunits: butyryl-CoA dehydrogenase, EtfA and EtfB, having apparent molecular masses of 41, 36, and 28 kDa, as revealed by SDS-PAGE. The activities were detected that the reduction of crotonyl-CoA to butyryl-CoA with NADH catalyzed by the complex was coupled with the reduction of ferredoxin, and the specific activity was 0.4 U/mg (NADH oxidation assay). In addition, the complex could catalyze the reduction of TTC and ferrocenium, and the specific activities were 0.35 and 0.14 U/mg, respectively. Furthermore, it was firstly reported that the reduction of NAD+ catalyzed by the complex from C. acetobutylicum was coupled with the oxidation of ferredoxin, but not coupled with the oxidation of butyryl-CoA.