| 题名 | 石斑鱼MicroRNAs在虹彩病毒SGIV和神经坏死症病毒RGNNV感染过程中的免疫调节作用 |
| 作者 | 尼松伟 |
| 答辩日期 | 2018 |
| 授予单位 | 南海海洋研究所 |
| 导师 | 秦启伟,王晓雪 |
| 关键词 | miRNA，石斑鱼，先天免疫，病毒 |
| 学位名称 | 博士 |
| 其他题名 | Immune regulation effects of grouper MicroRNAs during SGIV and RGNNV infection |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 英文摘要 | MicroRNA（miRNA）是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA序列，它可以通过碱基互补的方式与靶基因信使RNA（mRNA）分子结合，诱导mRNA分子的降解或使其翻译过程受阻，从而在转录后水平发挥调节基因表达的功能。在本实验室前期的工作中，已经对我国以及东南亚地区重要的海水养殖鱼类—石斑鱼编码的miRNA进行了序列鉴定，并对病毒感染前后石斑鱼miRNA的差异表达情况进行了检测。在此基础上，本文选择石斑鱼编码的miR-146a以及miR-181（包括miR-181a和miR-181b），在细胞水平研究了其对石斑鱼虹彩病毒SGIV（Singapore grouper iridovirus）和神经坏死症病毒RGNNV（Red-spotted grouper nervous necrosis virus）感染的影响，并从分子免疫学的角度探究了miRNA在石斑鱼抗病毒免疫调控网络中的作用机制，取得了以下研究成果：1. 阐明了miR-146a通过抑制病毒SGIV诱导的细胞凋亡以及胞内NF-?B信号活性，从而促进了病毒在细胞内的增殖。本研究发现，miR-146a在不同物种中具有很高的序列相似性，在斑马鱼、鲤鱼以及石斑鱼中更是具有完全相同的核苷酸序列，表明其具有高度的进化保守性。利用由病毒SGIV和细胞FHM（Fathead monnow）组成的感染模型，证实了高水平的miR-146a可以促进病毒SGIV基因的转录以及子代病毒的产生，而人为降低胞内miR-146a的表达水平则会产生抑制病毒感染的效果。进一步的研究发现，miR-146a会抑制病毒SGIV诱导的细胞凋亡，维持病毒生存和复制的细胞空间，同时抑制胞内NF-?B启动子活性，抑制NF-?B介导的细胞免疫反应，最终帮助病毒实现增殖的最大化。2. 证实了miR-146a可以通过靶向石斑鱼TRAF6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6）基因，抑制TRAF6介导的细胞免疫反应，进而促进神经坏死症病毒RGNNV的感染。在神经坏死症病毒RGNNV对石斑鱼细胞的感染过程中，也发现了高水平的miR-146a促进病毒基因转录的现象。随后，利用miRNA靶基因预测软件进行分析，发现石斑鱼免疫关键基因TRAF6 mRNA的3’非翻译区（Untranslated region，UTR）存在miR-146a的潜在靶点。进一步利用pMIR-REPORT荧光素酶报告基因系统，发现miR-146a确实可以特异性地结合该靶点并抑制基因的表达，即证实了石斑鱼miR-146a是通过抑制TRAF6介导的免疫反应，从而促进了病毒RGNNV的感染。3. 克隆了石斑鱼miR-181的预测靶基因，核受体共抑制因子辅因子EcTBLR1（Transducin β-like 1 X-linked receptor 1），并系统研究了其在病毒感染过程中对基因转录活性的调控机制。EcTBLR1蛋白编码框（Open reading frame，ORF）全长为1548 bp，编码515个氨基酸，其与大黄鱼以及人类TBLR1同源相似性高达99%和95%。在病毒SGIV或RGNNV感染以后，EcTBLR1均出现了蛋白表达水平降低，以及定位从细胞质向细胞核移动的现象；同时，其对细胞AP1，NF-?B以及IFN启动子活性的抑制作用也发生明显减弱甚至消失。随后，利用siRNA对EcTBLR1进行功能缺失之后，发现低水平EcTBLR1条件下病毒SGIV和RGNNV的感染都受到了抑制。依据这些结果我们推测，EcTBLR1在静息状态下负责胞内免疫反应的抑制，而在病毒感染时则可能参与了细胞核内免疫信号的转录激活过程。4. 对石斑鱼编码的miR-181分别在两种病毒SGIV和RGNNV感染过程中的功能进行了初步的探索，证实了其对病毒SGIV的感染具有抑制作用，并验证了其对EcTBLR1的靶向抑制作用。在对石斑鱼miR-181，包括miR-181a和miR-181b进行的初步研究中，我们发现病毒SGIV和RGNNV的的感染都可以上调miR-181的表达，而高水平的miR-181会抑制病毒SGIV基因的转录以及子代病毒的产生。随后，依据miRNA靶基因预测分析结果，通过Westernblot实验证实了miR-181可以靶向抑制石斑鱼EcTBLR1蛋白的表达，表明该基因是石斑鱼miR-181的一个靶基因。为了更深入地探究EcTBLR1在石斑鱼基因转录调控中的作用机制，以及miR-181靶向EcTBLR1与抑制病毒感染之间的联系，本研究还首次尝试在石斑鱼细胞中开展基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术，并成功构建了5个针对EcTBLR1的基因敲除质粒，期望能从EcTBLR1完全敲除的角度，进一步补充和完善上述实验结果。 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18015]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（博士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 尼松伟. 石斑鱼MicroRNAs在虹彩病毒SGIV和神经坏死症病毒RGNNV感染过程中的免疫调节作用[D]. 南海海洋研究所. 2018. |
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