本发明公开了一种鹰嘴豆防御素的制备方法及其应用，该方法将鹰嘴豆粉碎采用正己烷脱脂后，利用磷酸盐缓冲溶液提取、硫酸铵沉淀，并经阴、阳离子交换树脂分离，超滤纯化、HW?55F凝胶树脂凝胶柱层析分离纯化，得到分子量为5.483?kDa的鹰嘴豆防御素，其N?端氨基酸序列为：H2N?Ala?Cys?Cys?Glu?Asn?Lue?Ala?Asp?Thr?Tyr?Arg?Gly??Pro?Cys?Phe。属于植物防御素一族，经对本发明所述方法获得的鹰嘴豆防御素进行抑菌和抗癌活性实验表明：该鹰嘴豆防御素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具有较强的抑制作用，对人结肠腺癌细胞Caco?2有很强的抑制作用（C50值为1.74?μg/mL）。可进一步研究用于医药行业。