题名 | 地衣芽孢杆菌GXN151纤维素酶基因的克隆与表达 |
作者 | 刘永生 |
答辩日期 | 2003 |
文献子类 | 博士 |
授予单位 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
授予地点 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
关键词 | 地衣芽抱杆菌 基因文库 克隆 纤维素酶基因 表达 |
其他题名 | Cloning and expression of cellulase genes from Bacillus licheniformis GXN151 in Escherichia coli |
学位专业 | 微生物学 |
英文摘要 | 从广西大学农场陈旧稻草堆、甘蔗渣堆、龙胜温泉等地采集不同的土样和水样,从中共分离到10株能降解结晶纤维素的细菌、放线菌和真菌,对它们的165RNA或185 rRNA基因序列进行了分析,其中从稻草堆中分离到的好氧细菌GXN 151具有耐中温、生长迅速、能降解天然纤维素的特点。运用生理生化和电镜观察进一步将其鉴定为地衣芽抱杆菌。用pUC18和pBluescript KS+作载体,分别以CoR工和品u3AI部分酶切的GXN 151的总DNA作目的片段,在大肠杆菌中构建了地衣芽抱杆菌GXN151的2个基因文库。运用含狡甲基纤维素的平板筛选法,从GXN151的基因文库中共筛选到14个表达梭甲基纤维素酶(CMCase)活性的克隆,采用酶切分析、亚克隆、Southern杂交、DNA测序分析将这些克隆划分为3类不重叠克隆群。pGxNLI、pGXNLZ、pGxNL7、pGxNP12和pGxNPI~pGXNP6共10个克隆归为一类重叠克隆,测序分析了PGXNLZ的序列,其长度为3672bP,其上含有一个完整的长1626 bp的ORF(GenBonk索引号为AY291583),可编码一个含542个氨基酸的内切葡聚糖酶Ce15A,其预计分子量为59,625D娜Ce15A含有家族5糖基水解酶催化功能域和家族3碳水化合物结合组件(CBM3)。PCR 扩增了ceJSA的编码框并将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)上,酶谱分析表明该基因在大肠杆菌JM109(DE3)和BL21(DE3) pLysS中均表达出具梭甲基纤维素酶活性的蛋白质产物。克隆pGxNLg测序共得5818bp,pGxNLg序列中含有一个完整的内切葡聚糖酶基因cel12A(GenBaok索引号为AY291066)和一个外切-Q-葡萄糖营酶基因amyA,cel12A长783 bp,可编码含261个氨基酸的蛋白质,预计分子量为29,035 Da,含有一个家族12糖基水解酶催化功能域。amyA为1680bP,推断其编码含560个氨基酸的蛋白质,预计分子量为65,121 Da。PCR扩增了cel12A基因的含催化功能域编码区的DNA序列并连接到表达载体pET30a(+)上得表达质粒pGxN12A,pGXN 12A在大肠杆菌JM1O9(DE3)和BL21(DE3)pLysS中均J高效表达,并对表达条件进行了研究。克隆pGXNLS、pGXNPS和pGXNpn为一类重叠克隆,测序表明pGxNPll克隆的序列共为3406bP,它包括了一个完整的内切葡聚糖酶基因ce19A和一个不完整的纤维二糖水解酶基因ce148A,ce19A基因由1899bP组成,可编码一个含633个氨基酸的蛋白质,预计分子量为71,240Da。ce19A基因的产物Ce19A含有一个家族9糖基水解酶催化功能域和一个家族3碳水化合物结合组件(CBM3)。Ce148A属于糖基水解酶第4S家族,DNA杂交表明cel48A基因的未被克隆的下游序列位于一个约10kb的SaLI片段或4kb的EcoRI片段上。 |
语种 | 中文 |
公开日期 | 2010-12-15 |
页码 | 132 |
内容类型 | 学位论文 |
源URL | [http://210.72.129.5/handle/321005/3261] ![]() |
专题 | 沈阳应用生态研究所_沈阳应用生态研究所 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘永生. 地衣芽孢杆菌GXN151纤维素酶基因的克隆与表达[D]. 中国科学院沈阳应用生态研究所. 中国科学院沈阳应用生态研究所. 2003. |
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