题名 | 苍白杆菌降解三氯卡班及其降解关键酶的基因克隆与表达 |
作者 | 云 慧 |
答辩日期 | 2017-06 |
文献子类 | 博士 |
授予单位 | 中国科学院大学 |
授予地点 | 北京 |
导师 | 王爱杰 |
关键词 | 三氯卡班 Ochrobactrum Sp. Triclocarban 酰胺酶tcca Ochrobactrum Sp. 氯苯胺 Amidase Tcca 生物降解 Chloroanilines Biodegradation |
其他题名 | Degradation of Triclocarban by Ochrobactrum sp.and the Gene Cloning and Expression of Key Enzyme |
学位专业 | 环境工程 |
英文摘要 | 三氯卡班(Triclocarban,TCC)是一种广谱氯代芳香抗菌剂,大量的应用于 日常生活各类个人护理用品、消毒液以及备用品中,对革兰氏阴性、阳性菌和真 菌都有一定的抑制作用。由于TCC 水溶性极差,导致污水处理过程中活性污泥 吸附是其主要的去除途径,最后随剩余污泥排放到环境中。环境中的TCC 非常 稳定,在各种水体和底质环境中均被频繁检出,不仅会影响水生藻类的活性,还 对动物的生殖能力和内分泌造成影响,并且TCC 及其转化产物为潜在诱癌物, 同时也具有诱发微生物抗性基因产生的风险。我国是TCC 的使用大国,近些年 来TCC 在我国乃至全球开始得到广泛的关注。利用微生物进行TCC 的降解是一 种有效、经济和绿色的去除方法。因此,富集分离出高效的TCC 降解菌,丰富 TCC 的降解菌种资源,研究其降解分子机理,发掘其生物修复潜质,为强化生 物修复TCC 污染环境提供理论与技术基础。 本研究旨在于针对二级出水及环境介质中TCC 残留进行进一步的生物强化 处理,以期达到去除、脱毒无害化的效果,丰富TCC 降解菌的微生物多样性, 重点挖掘TCC 双酰胺键水解酶编码关键基因,为表征TCC 在生物修复过程中的 催化活性提供重要的分子标记;同时在分子和生化水平上揭示TCC 的微生物降 解途径和分子机理。 本研究从不同地点分离得到两株三氯卡班降解菌,两菌不能利用TCC 为唯 一碳源进行生长,水解TCC 中双酰胺键生成4-氯苯胺(4CA)和3,4-二氯苯胺 (DCA),两株菌经16S rRNA 基因鉴定均属于Ochrobactrum sp.,命名为菌株 TCC-1 和TCC-2,可在温度和pH 范围为20℃-40℃和5.2-9.0 下降解TCC,增大 接种量和提供共基质可以促进TCC 的降解和产物的积累,两株菌可以耐受较高 的TCC 浓度(>30mg/L)。 通过构建降解菌TCC-2 的基因组DNA 文库,获得了一个阳性克隆子U135, 能有效降解TCC 的双酰胺键生成4CA 和DCA,该基因编码的酰胺酶命名为TccA (GenBank 登录号KU753911),核酸序列大小为1425bp,编码474aa。与NCBI 数据库中Swiss-Prot 专业数据库中蛋白序列进行比对发现,TccA 与Rhodococcus sp. Oct1 中生化鉴定的邻硝基乙酰苯胺水解酶OctH 最高同源性38%,与来自 Streptomyces 推定酰胺酶同源性介于51%-53%,TccA 为一个全新的具有酰胺键 水解功能的酰胺酶。进一步比对分析发现,TccA 含有酰胺酶家族中高保守氨基 酸motif 区域GGSSGG,和该家族催化保守三分子(Lys98-Ser176-Ser200)。在 E. coli BL21 中高效表达了TccA,确定其分子量为50 kDa,为单体蛋白。 TccA 在温度低于70℃和pH 在5.0-10.0 之间时,酶的催化活性保持较好, 在偏碱性pH 条件下,酶的稳定性和催化活性都与最适反应条件差异不大。TccA 反应最适温度为35℃,最适pH 为8.0。1 mM 金属离子中仅Ag+对该酶有强烈抑 制作用,化学抑制剂1,10-邻菲啰啉、对甲基磺酰氟、吐温-80 和焦碳酸二乙酯可 抑制40%-60%酶催化活性。TccA 作用底物具有广谱性,不仅可以水解TCC 及其 脱卤同系物4,4’-二氯苯基脲(4,4’-dichlorocarbanilide, DCC)和双苯基脲 (carbanilide, NCC)的双酰胺键,还可以水解部分除草剂、杀虫剂和化学合成中 间体,包括除草剂敌稗,利谷隆,苯胺灵,氯苯胺灵,除虫剂除虫脲,化学合成 中间体4-氯苯基脲,4-溴苯基脲,1-(3,4-二溴苯基)脲,乙酰苯胺,医药品对 乙酰氨基酚和植物生长调节剂氯吡脲,其中TCC,DCC,NCC,除虫脲和氯吡 脲可以水解两个酰胺键。通过测定酶活力参数,最高值对应底物NCC,其次为 TCC,均大于DCC。该酶的表达不受底物的诱导,经RT-qPCR 确认TccA 为组 成型表达,这对于去除环境中低浓度底物残留具有重要意义。通过比较两株TCC 降解菌tccA 基因附近的区域发现,含有多个编码转座酶和整合酶的序列,推测 TCC 降解菌属Ochrobactrum 中该基因可能由基因水平转移进化而来。 基于TCC 大量存在的沉积物和生物质通常氧气不足,因此在微氧/厌氧条件 下以硝酸盐作为电子受体进行Ochrobactrum sp. TCC-1 的培养,同样可以水解 TCC,DCC,NCC 为氯苯胺和苯胺产物。微氧及碳氮比高的条件更利于降解菌 生物量积累,及促进底物水解效率。在厌氧剩余污泥体系中批次补充一定的电子 受体硝酸盐,发现可以支持菌株TCC-1 的定殖和底物TCC 水解,氯苯胺产物持 续积累,生物量也可以稳定在一定的水平,这些结果为基于生物刺激和生物强化 的TCC 污染环境生物修复奠定了理论基础。 另外,从污水处理厂剩余污泥中分离得到TCC 降解产物氯苯胺的高效降解 菌,该菌可以利用3,4-二氯苯胺作为唯一碳源、氮源和能源生长,该菌经16S rRNA 基因鉴定属于Diaphorobacter 菌属,命名为Diaphorobacter sp. LD72。不同的碳 氮源对该菌生长和底物降解的影响不同,丙氨酸和有机氮源对生长和降解的促进 明显,菌株LD72 也可以降解苯胺,间位和对位取代的一氯和二氯苯胺和溴代的 苯胺,4-氟苯胺,对不同浓度的底物适应性也较强,降解过程伴随当量摩尔的卤 离子释放,基于基因组测序分析推测双加氧酶参与卤代苯胺降解过程。当将氯苯 胺的降解菌LD72 与TCC 的降解菌TCC-2 共培养作用于TCC 的降解时,可以实 现TCC 的矿化,这为后期环境中TCC 的彻底去除奠定实验基础. |
内容类型 | 学位论文 |
源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/38739] |
专题 | 生态环境研究中心_中国科学院环境生物技术重点实验室 |
作者单位 | 中国科学院生态环境研究中心 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 云 慧. 苍白杆菌降解三氯卡班及其降解关键酶的基因克隆与表达[D]. 北京. 中国科学院大学. 2017. |
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