| 题名 | 鼠源天然抗体噬菌体展示文库的构建及抗草鱼IgM的单链抗体的淘选 |
| 作者 | 陈丛琳 |
| 学位类别 | 硕士 |
| 答辩日期 | 2010-12 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 导师 | 戴和平 |
| 关键词 | 鼠源天然抗体噬菌体展示文库 草鱼呼肠孤病毒 IgM 单链抗体 |
| 其他题名 | Construction of Mouse Naïve Antibody Phage-Display Library and Panning of Single Chain Fragment of Variable (scFv) Antibodies against IgM from Grass Carp (Ctenopharyngodon idellus) |
| 中文摘要 | 抗体是研究蛋白表达水平与诱导信号相互关系的有力工具，该研究通过构建鼠源天然抗体噬菌体展示文库，用纯化的草鱼IgM从中淘选得到特异识别草鱼IgM的单链抗体，用于草鱼对呼肠孤病毒（GCRV）免疫应答的检测。 鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA文库的构建，是从未免疫过的、健康小鼠的骨髓干细胞、外周血淋巴细胞和脾脏细胞中提取和扩增抗体的可变部分基因，与丝状噬菌体M13的P3蛋白基因融合，使抗体以融合蛋白的形式在噬菌体表面展示。由于避免了免疫步骤，收集了骨髓内和骨髓外所有抗体基因，包括自身免疫抗体在内，使该抗体库的多样性大大增加，适用于多种抗原所对应的抗体的选择。本研究构建了高容量的鼠源天然抗体噬菌体展示文库，库容量达到1.2×109。从该抗体库中可以方便地获取针对各种抗原的特异性抗体，避免了针对不同抗原反复构建抗体库的重复工作。 通过技术改进，以硫酸铵盐析法和Protein A柱层析，获得纯化的草鱼IgM。利用SDS-PAGE技术，确定草鱼IgM的重链分子量为75.8kD，轻链分子量为28.2kD，推算其单体分子量应在208kD左右。非还原SDS-PAGE的结果分析显示，草鱼IgM完整的蛋白分子量约800kD，是4个单体的总和，证明了草鱼IgM的四聚体构型。 用纯化的草鱼IgM从鼠源天然抗体噬菌体展示文库中淘选得到特异识别草鱼IgM的单链抗体，对部分单链抗体的基因进行了测序分析。所有阳性克隆的单链抗体只识别草鱼IgM的空间抗原表位，不识别线性抗原表位。 草鱼出血病是草鱼鱼种培育阶段一种广泛流行、危害性较大的病毒性疾病。为研究草鱼对呼肠孤病毒（GCRV）的免疫应答，以硬骨鱼类免疫球蛋白中含量最高的重要免疫应答分子IgM水平为指标，利用单链抗体检测感染呼肠孤病毒的草鱼血清中IgM的诱导表达水平变化。结果显示，攻毒第四天之后，IgM水平上升，6、7天后到达高峰。而感染呼肠孤病毒草鱼血清中特异结合病毒的IgM的实验没有得到预期结果。可能是病毒样品质量不高，浓度过低，或提取后破损很多而导致的。因此本研究的下一步需要改进病毒提取方法，也可用病毒基因表达抗原代替病毒包被ELISA板孔，藉此判断与病毒基因对应的病毒蛋白的 I 硕士学位论文：鼠源天然抗体噬菌体展示文库的构建及抗草鱼 IgM 的单链抗体的淘选 抗原性。 本研究的创新点和贡献在于，摸索改进了建库方法，提高了电转化效率，成功构建了高容量鼠源天然抗体噬菌体展示文库；完善了草鱼IgM四聚体结构分析数据；在原来蔗糖梯度和超速离心的基础上，简化了GCRV提取方法；更为草鱼对GCRV的免疫应答反应提供了方便的检测工具和方法，并进行了初步研究，也为寻找有效的重组疫苗提供了可用的抗体工具。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-12-27 |
| 页码 | 54 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/13799]  |
| 专题 | 水生生物研究所_水生生物分子与细胞生物学研究中心_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 陈丛琳. 鼠源天然抗体噬菌体展示文库的构建及抗草鱼IgM的单链抗体的淘选[D]. 中国科学院水生生物研究所. 2010. |
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