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题名	PAX6和miR-219在人胚胎干细胞向神经分化过程中的功能研究
作者	张燕琪
答辩日期	2017-03-01
文献子类	硕士
授予单位	中国科学院大学
授予地点	广州生物院
导师	潘光锦
关键词	人胚胎干细胞 CRISPR/Cas9 PAX6 miR-219 基因敲除 神经分化
学位名称	工程硕士
其他题名	Studies on the Roles of PAX6 and miR-219 in Neural Differentiation of Human Embryonic Stem Cells
学位专业	生物工程
英文摘要	人胚胎干细胞（hESCs）具有分化为各种神经细胞的潜能，其在神经分化过程能够最大程度地模拟体内的人胚胎神经发育，通过在hESCs中敲除神经分化过程中的重要调节因子，分析在这些重要调节因子缺失的情况下，来源于hESCs的神经干细胞的获得、增殖和分化等特性的改变，可以揭示这些调节因子在人神经发育过程中的重要作用。已有研究结果表明，PAX6和microRNA miR-219在神经系统发育中有着重要作用。PAX6基因突变会导致多种症状，如人类无虹膜、虹膜发育不全、瞳孔异位、神经发育紊乱、视神经发育不良等。在小鼠胚胎Pax6连续性基因缺失是纯合致死，而杂合子缺失小鼠会表现眼睛变小和腹部发育不良。但目前PAX6在人神经分化过程前脑发育、脑部分区及神经干细胞自我更新、增殖和神经元分化的作用仍不清楚。另外，已有研究发现核受体TLX抑制miR-219加工，而miR-219会抑制神经干细胞增殖和促进神经元分化。本实验室前期研究中，用TGF-β抑制剂SB431542和BMP抑制剂Dorsomorphin诱导hESCs得到的神经祖细胞进行RNA测序发现miR-219在神经祖细胞相对hESCs表达提高10倍，并证明在hESCs的体外神经分化过程中miR-219表达呈逐步上升趋势。但miR-219在人神经分化过程前脑发育、脑部分区及神经干细胞自我更新、增殖和神经元分化的作用仍不明确。为了进一步阐明PAX6基因和miR-219 在hESCs向神经元诱导分化过程中的重要功能，本研究将PAX6从hESCs中敲除，研究PAX6的缺失对hESCs来源的神经干细胞的获得、增殖和分化等特性的影响；另外，建立miR-219过表达和敲除的hESCs细胞系并进一步研究其神经分化，其中miR-219是首次在hESCs中实现敲除。本研究选择简单有效的CRISPR/Cas9人工核酸酶作为基因打靶工具，对PAX6的功能结构域进行成功敲除后，qPCR分析、免疫荧光和流式细胞术检测结果表明，PAX6的缺失不改变 hESCs的多能性。进一步的神经诱导实验表明，与野生型hESCs一样， PAX6-/-hESCs能诱导形成典型的神经花环结构，免疫荧光和流式细胞检测均证明了神经干细胞的成功获得。通过流式细胞术检测，我们发现PAX6-/-hESCs来源的神经干细胞相对于野生型，细胞增殖速率变快，进一步的流式细胞检测表明PAX6的缺失导致了细胞周期发生变化，处于G1期细胞比例减少，而S期的细胞比例增加。另外，TUNEL染色结果表明PAX6-/-hESCs细胞凋亡水平不变。在miR-219的研究中，于hESCs中分别过表达miR-219的两个亚型miR-219-1和miR-219-2，通过qPCR分析和流式细胞术检测，我们发现神经干细胞诱导效率没有出现预期中显著提高的现象；分别对miR-219-1和miR-219-2的pri-miRNA进行完全敲除，miR-219-1和miR-219-2的缺失不影响hESCs多能性的维持；并且不影响干细胞的神经分化效率。本研究成功建立PAX6和miR-219完全敲除的hESCs细胞系，并对两种调节因子在hESCs向神经干细胞分化过程中的作用进行初步探讨研究，为揭示PAX6和miR-219在人神经分化中的作用奠定了基础，对进一步的研究具有重要意义。
语种	中文
学科主题	生物工程
页码	79
内容类型	学位论文
源URL	[http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1130]
专题	中国科学院广州生物医药与健康研究院
作者单位	中国科学院广州生物医药与健康研究院
推荐引用方式 GB/T 7714	张燕琪. PAX6和miR-219在人胚胎干细胞向神经分化过程中的功能研究[D]. 广州生物院. 中国科学院大学. 2017.

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