| 题名 | 转录因子及基因点突变的快速检测方法研究 |
| 作者 | 方志远 |
| 答辩日期 | 2012-07-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 曾令文 |
| 关键词 | 转录因子 点突变 胶体金 侧向层析 电化学检测 |
| 学位名称 | 博士 |
| 其他题名 | Rapid detection of transcription factors and point mutations |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | 目前许多已知的肿瘤是由基因或蛋白的变异引起的，其中很大一部分涉及肿瘤信号通路相关的转录因子活性改变或基因突变，这些变化与肿瘤的发生、侵润转移和耐药性等方面密切相关。这些转录因子和基因突变的早期、准确、简便、快速的诊断，对于疾病的早期治疗、用药指导和发病机理研究具有非常重要的意义。传统的方法普遍存在操作繁琐费时、仪器昂贵、且对工作人员专业技能要求较高等不足，只能在专门的实验室进行，因此开发一些简便、价廉、精确且易于普及推广的检测方法是一件很有价值的工作。基于当前检测中的一些问题，我们开展了一系列新的检测方法的探索，并实现了对转录因子和基因点突变的快速检测。主要内容分以下两部分： (1)转录因子的检测 本课题在国内外首次提出核酸-蛋白胶体金双夹心免疫侧向层析的方法来检测转录因子的活性。该检测卡由四部分组成：样品垫、金标垫、硝酸纤维膜和吸水纸。通过在胶体金上标记具有转录因子结合序列的生物素标记的双链DNA，利用该双链DNA与转录因子的特异性结合，将胶体金捕获到固定有转录因子单克隆抗体的检测线上。该方法可在10分钟之内完成对低至100 μg全蛋白提取物中c-Jun蛋白活性的检测，检测过程不需要任何仪器的使用，检测结果肉眼可见。 (2)基因点突变检测 基于单碱基延伸方法，利用引物与模版在变性温度附近的动态结合实现核酸扩增，产生biotin标记的延伸产物，该产物不用经过任何处理就可以直接用侧向层析胶体金法和电化学法检测。如采用胶体金法，点突变的检测可在30分钟内完成，灵敏度为1 nM，检测结果肉眼可见。为提高检测灵敏度，我们同时开发了电化学法检测法，其检测灵敏度为1 pM。本检测方法的最大特点是操作简单，只需将反应体系置与小杯沸水中，让其自然冷却即可。而且该反应体系简单稳定，在变性温度上下均能进行扩增和延伸，具有高度的特异性。 综上所述，这几种方法均克服了传统仪器检测中操作繁琐、费时及费用高的缺点，实现了扩增及检测整个过程的简单化，为进一步研究检测的自动化奠定基础。同时，该研究成果可提供稳定可靠的快速检测产品，可为实际应用节省了大量人力和财力，具有广泛的应用价值和社会效益。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 97 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/1003]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 方志远. 转录因子及基因点突变的快速检测方法研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2012. |
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