| 题名 | 人C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白的表达及功能研究 |
| 作者 | 李洪波 |
| 答辩日期 | 2011-05-20 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 广州生物院 |
| 导师 | 吴东海 |
| 关键词 | CTRP 脂联素受体 蛋白相互作用 |
| 学位名称 | 博士 |
| 其他题名 | Expression and function studies human C1q/TNF-related protein |
| 学位专业 | 生物化学与分子生物学 |
| 英文摘要 | CTRP是一类在结构和功能上与脂联素类似的分泌蛋白。CTRP在能量代谢、炎症反应、宿主防御、细胞凋亡、细胞分化、自体免疫和器官形成等生理过程中具有重要作用。为深入了解人CTRP的功能和作用机理，我们分别利用酵母和大肠杆菌表达系统对其进行表达和纯化。hCTRP1及hCTRP2可以在酵母表达系统中分泌表达，但表达的产物很不稳定，极易被降解。利用pET-32a(+)为表达载体，实现了hCTRP1及其球状区蛋白（ghCTRP1）、hCTRP2及其球状区蛋白（ghCTRP2）和hCTRP6在大肠杆菌表达系统中的高水平、稳定且可溶表达。利用镍亲合层析和分子筛等纯化方法，实现了表达产物的大量纯化。C2C12细胞活性测定表明：hCTRP1及其球状区蛋白、hCTRP2及其球状区蛋白与Trx融合表达的产物具有生物活性。动物降血糖效果测定表明：Trx-hCTRP1和Trx-hCTRP2具有良好的降血糖活性，Trx-hCTRP6的降血糖作用有限。 将人脂联素受体基因adipoR1和adipoR2克隆到pCMV-3FLAG载体，经转染HEK293细胞和G418筛选，得到稳定表达adipoR1和adipoR2的细胞。激光共聚焦和免疫荧光分析表明：稳定株细胞表达的adipoR1-3FLAG和adipoR2- 3FLAG分布于细胞膜和细胞质中，且adipoR1和adipoR2的C-端位于细胞膜外N-端位于细胞膜内。Trx-ghCTRP1及Trx-ghCTRP2分别刺激稳定表达adipoR1和adipoR2的细胞，Western blot结果分析表明，稳定株细胞的相关信号通路蛋白的磷酸化激活水平要高于对照组细胞。Trx-ghCTRP1及Trx-ghCTRP2经FITC标记，通过孵育稳定株细胞、经流式细胞仪分析，其荧光值要显著高于对照组细胞。经嘌噙霉素筛选得到稳定干扰adipoR1及adipoR2的HEK293细胞株，经real-time PCR分析，筛选得到的稳定干扰adipoR1及adipoR2细胞的adipoR1及adipoR2干扰效率都超过90%。Trx-ghCTRP1及Trx-ghCTRP2分别刺激adipoR1及adipoR2 knock down的细胞，结果表明，knock down细胞的相关信号通路蛋白的磷酸化水平要显著低于对照组细胞。超表达、流式细胞分析和RNA干扰结果表明，Trx-ghCTRP1及Trx-ghCTRP2与adipoR1和adipoR2之间存在相互作用，hCTRP1和hCTRP2能通过adipoR1及adipoR2来传递相关信号。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 生物化学与分子生物学 |
| 页码 | 105 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://ir.foo.ac.cn/handle/2SETSVCV/976]  |
| 专题 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 作者单位 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李洪波. 人C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白的表达及功能研究[D]. 广州生物院. 中国科学院研究生院. 2011. |
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