| 题名 | 黏着斑激酶抑制剂诱导巨噬细胞融合成多核巨噬细胞的研究 |
| 作者 | 何霞 |
| 答辩日期 | 2016-05 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 姬建新 |
| 关键词 | Fak抑制剂 多核巨噬细胞 细胞-细胞融合 吞噬能力 肿瘤免疫抑制 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 英文摘要 | 黏着斑激酶抑制剂诱导巨噬细胞融合成多核巨噬细胞的研究生物工程专业硕士研究生：何霞 指导教师：姬建新 摘要巨噬细胞分布在机体的各个组织，是机体免疫的重要成员，具有提呈抗原、吞噬细菌、分泌多种细胞因子和可溶性蛋白的功能。巨噬细胞是一种具有很强可塑性的细胞，其细胞表型受到所处微环境的严密调控。巨噬细胞应答于不同的刺激，如不同的细胞因子，向不同类型分化或极化。巨噬细胞也是体内少数能够进行细胞融合的细胞之一。巨噬细胞能通过细胞融合分化成具有降解外植体功能的FBGCs（Foreign Body Giant Cells)、具有骨质吸收的功能的破骨细胞、以及其它类型的多核巨大细胞（Multinucleated Giant Cells，MGCs）。黏着斑激酶（Focal adhesion kinase，FAK）是位于细胞胞浆内的一种非受体酪氨酸激酶，介导着细胞与细胞以及细胞与细胞基质之间的粘附和移动。FAK在多种肿瘤中高表达，参与肿瘤细胞的迁移和侵袭过程，是抑制肿瘤侵袭转移的热门靶点。针对FAK已经研发出多种抑制剂，其抑制机理都是通过竞争性结合ATP从而抑制FAK的磷酸化，如Y397和Y576/577位点的磷酸化，从而阻断其下游信号通路，其中PF573228,NVP-TAE226目前处在临床前研究。在本文中我们首次报道了FAK抑制剂（PF573228，NVP-TAE226）能够有效诱导体外培养的RAW264.7 巨噬细胞融合成多核巨噬细胞。本论文分别从融合机理、细胞类型、细胞功能、细胞融合后的影响对FAK抑制剂诱导RAW264.7 巨噬细胞融合这一现象进行研究和探讨，探索了FAK抑制剂与巨噬细胞的相互作用。主要结果如下：第一、黏着斑激酶抑制剂通过细胞-细胞融合诱导巨噬细胞成多核细胞，其诱导效果呈时间浓度依赖关系。第二、1）在细胞融合发生前和融合继续发生的时间点都检测到Syncytin A，B以及各自的受体，如ACST2，1和Mfsd2A的表达量的升高。然而，作为已报道的对破骨细胞或多核巨噬细胞融合中至关重要的基因，如OC-STAMP,DC-STAMP,KCNN4,Atp6v0d2,我们没有检测到这些基因的表达量上调，相反地其中一些基因表达量受到了剧烈的下调，与对照相比，这些基因的mRNA表达量分别下降了65%,99%,47%,36%，其中OC-STAMP的表达量几乎降为0。提示在FAK抑制剂的诱导下，巨噬细胞可以不通过OC-STAMP,DC-STAMP,KCNN4,Atp6v0d2进行细胞融合。2）另外我们检测到在细胞融合过程中Rac1保持着持续的激活。3）在细胞融合后期（PF573228处理细胞48hrs），一些趋化因子如CCL2、3、5、 7等，金属基质酶如MMP2、9等，以及其他细胞因子如TNF-a、iNOS、 Arg-1、IL-6都有数倍至数十倍的上调。这些数据提示黏着斑抑制剂可能通过激活Rac1和上调Syncytin A，B以及各自的受体的表达量，起始了早期的融合，趋化因子和金属基质酶促进了后期的融合。第三、1）FAK抑制剂诱导的MGCs抗酒石酸钠磷酸酶染色结果为阴性。2）同时也没有检测到破骨细胞特异性表达的蛋白，如DC-STAMP、Cathepsin K、RANKL、TRAP的mRNA水平的升高。这些数据表明黏着斑抑制剂诱导的多核细胞不是破骨细胞；3）F4/80-PE标记该MGCs进行流式细胞仪检测，流式数据显示该MGCs细胞中F4/80+的细胞约为85.42%，对照组约为79.53%，并在荧光显微镜下观察F4/80-PE标记的MGCs，也证明了该MGCs为F4/80+，这些数据表明PF573228或TAE226诱导的MGCs是多核巨噬细胞。4）用荧光微球饲养PF573228诱导的多核细胞，通过流式细胞仪检测细胞内荧光强度和激光共聚焦3D成像，流式数据显示吞噬能力增强了约3倍，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，诱导MGCs的吞噬能力显著增强，这些数据表明所得的数据表明FAK抑制剂诱导的MGCs的确具有更强的吞噬能力。第四、该多核细胞为某种或混合的极化的巨噬细胞。利用qRT-PCR手段检测了M1型，M2a、b、c、d的表型marker，根据所得数据，不能将其归为某一类，因为PF573228诱导的MGCs这五种分型的marker都有表达,提示FAK抑制剂诱导的多核巨噬细胞可能为一类混合的极化了的多核巨噬细胞。第五、对PF573228诱导细胞融合前后巨噬细胞表达的细胞因子的mRNA和蛋白水平进行了检测，我们发现：1）在细胞融合前，大量细胞因子下调；2）细胞融合导致细胞/趋化因子的上调；我们通过Western-blot检测了IL-1β、TNF-a、MMP9、MMP2的蛋白表达水平，结果表示IL-1β、TNF-a、MMP9、在72hrs和96hrs都明显升高，MMP2在24hrs和96hrs也有明显升高，同时用Griess法检测细胞培养上清的NO含量，发现PF573228处理细胞后，与对照相比，24hrs降低了60%，36hrs开始恢复正常水平，60hrs和72hrs分别升高了2.2和2.4倍。这些数据表明这些因子的下调是因为FAK抑制剂抑制FAK磷酸化引起的，而后期的上调是由细胞融合引起的。3）我们检测到p-ERK,p-P38的磷酸化水平显著升高，并没检测到p-JNK的升高，说明p-ERK,p-P38可能参与到细胞因子的分泌过程。4)另外，部分因子的表达水平在细胞融合后发生了剧烈的变化，如CCL17、CCL22、IL-1β、MMP12在48h检测mRNA水平分别已经升高了约130.8、50.2、120.5、771.2倍。目前越来越多的研究表明，高水平的CCL22、CCL17通过吸引免疫抑制细胞Treg 细胞至肿瘤微环境中，从而导致肝细胞癌、胃癌、子宫癌的肿瘤免疫逃逸。同时这些剧烈升高的细胞因子与多种疾病相关，如动脉粥样硬化，特异性肺部纤维化等。综上，本研究首次报道了黏着斑抑制剂诱导巨噬细胞融合的现象，并对其融合机理做了进一步的探索，发现FAK抑制剂可能通过激活Rac1,使细胞膜产生突起结构，进而使得相邻的细胞膜接近，同时FAK抑制剂通过升高Syncytins及其受体的表达，从而启动了细胞-细胞融合。进一步地，我们发现FAK抑制剂诱导的巨噬细胞融合对因子的表达有极大地改变，导致CCL17、CCL22、MMP12在多种肿瘤中导致肿瘤免疫耐受的趋化因子的表达量剧烈上调。巨噬细胞具有极大的表型可塑性易受各种因素影响，又参与多种疾病的发生发展。我们的研究为研究药物同生物体的相互作用提供了新的视角。同时，我们的研究提示了一种可能性即抗肿瘤药物PF573228,NVP-TAE226有可能能够通过影响巨噬细胞作用于肿瘤微环境反过来促进肿瘤免疫耐受,提示FAK抑制剂PF573228,NVP-TAE226可能存在潜在的风险。 |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 天然产物研究 |
| 产权排序 | 1 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28846]  |
| 专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 何霞. 黏着斑激酶抑制剂诱导巨噬细胞融合成多核巨噬细胞的研究[D]. 中国科学院大学. 2016. |
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