| 题名 | 基于Wnt信号通路的新型重组蛋白抗肝癌活性以及相关长链非编码RNA的筛选 |
| 作者 | 曾中秋 |
| 答辩日期 | 2016-05 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 唐亚雄 |
| 关键词 | Wnt信号通路 肝癌 融合蛋白 Crd结构域 Lncrnas |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 英文摘要 | 肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，死亡率位居癌症死亡率前列。由于肝癌诊治手段有限，肝癌主要以中晚期肝癌患者为主。当前手术切除、肝脏移植和局部消融等治疗方法仅对于早期肝癌患者显现一定疗效，对于中晚期肝癌特别是伴有局部扩散和远处转移患者的预后差，术后复发率高，未能显著延长病人生存期及改善患者生存质量。新时代抗肿瘤治疗要求实现个性化精准医疗来达到疗效最大化，而具有高效、低毒、特异性强等特点的分子靶向药物把个体化肿瘤治疗推向了一个前所未有的新阶段。在现有的小分子或单抗类分子靶向药物中，仅索拉菲尼能够略微提升肝癌患者总体生存期，其他药物均因疗效低或毒性强止步于临床期，所以迫切需要寻找疗效及安全性更为显著的新型分子靶向药物。重组蛋白类药物虽然生产条件苛刻，价格昂贵，但相比于小分子药物，安全性更高，临床试验期更短，具有较高的批准率。因此，研发基于肝癌新靶点的重组蛋白质药物或许对于肝癌个性化防治具有重大临床应用价值。此外，个性化精准医疗还要求对肿瘤基因表型进行分子分型，以便精确的判断肿瘤的生物学行为、估计预后并选择或研究更有针对性的个性化治疗方案。肝癌发生过程复杂，具有高度异质性，与其他实体瘤显著不同，常规的肿瘤分型生物标志物EGFR、KRAS等在肝癌中并不适用，因此，亟需寻找新的肝癌分子生物标志物，确定肝癌基因表型分类亚群，推动肝癌精准医疗。在多种肿瘤中发现Wnt信号通路异常，尤其在肝癌中，约20 %以上的肝癌组织中CTNNB1基因发生突变，揭示以Wnt信号通路作为出发点对于肝癌的分子靶向个性化治疗具有重大的指导意义。因此，本研究拟从Wnt信号通路入手，设计新型抗肿瘤Wnt拮抗重组蛋白以及筛选肝癌相关lncRNA，以期寻找具有巨大潜力的抗癌生物活性重组蛋白及肝癌发生过程中重要的lncRNA，为肝癌的筛查、治疗、预防提供新的策略。研究目的 1. 以Wnt拮抗蛋白Frzb的CRD结构域为基础，设计、制备具有较强抗肝癌活性的新型重组蛋白，为肝癌生物大分子药物研究奠定临床前期试验基础；2. 以Wnt拮抗蛋白Frzb抗肝癌活性为出发点，筛选发现一些在肝癌发生中起着重要功能的lncRNA，为肝癌的个性化防治提供新机制、新靶点、新生物标志物；研究方法1. 融合基因片段的克隆：通过RT-PCR方法从HL-7702细胞系中获得cDNA，然后通过PCR将所需基因片段一一克隆，部分片段通过全基因合成的方法获得；2. 融合基因的构建：通过融合PCR的方法，将获得的片段与Frzb CRD片段进行重组拼接，构建融合基因；3. 融合基因慢病毒重组表达载体的构建：通过分子克隆手段构建融合基因的重组慢病毒表达载体，酶切测序鉴定克隆正确后，瞬时转染HEK293T细胞，48小时后提取蛋白，通过western blot检测标签表达情况，以确定融合基因正确表达；4. 融合基因稳定表达肝癌细胞株的建立：通过Lenti-X Lentiviral Expression Systems，即将融合基因慢病毒重组表达载体与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G按一定比例共转染HEK293T细胞，48小时后制备重组慢病毒悬液，再通过慢病毒感染结合适宜浓度嘌呤霉素筛选建立稳定表达融合基因的肝癌细胞株；5. 融合基因体内抗肝癌活性评估：通过建立裸鼠皮下移植瘤模型与尾静脉注射肺转移模型，评估融合基因在体内对肝癌致瘤性与肺转移能力的影响；6. 融合基因对于Wnt信号的影响：通过同源建模的方法预测融合蛋白三维结构，然后通过分子对接模拟配体-受体相互作用，再进一步通过双荧光素酶报告基因检测系统验证，即将融合基因重组表达载体分别与TOP Flash质粒和FOP Flash质粒共转染于HepG2细胞中，24h后检测融合基因对于Wnt信号通路是否仍具有抑制作用；同时，蛋白质免疫共沉淀用于验证是否融合基因能与Wnt1相互作用。7. 体外表达与纯化融合蛋白：分别采用大肠杆菌表达系统和CHO表达系统表达融合蛋白，最后通过Co2+柱和GST柱亲和纯化目的蛋白；8. 重组蛋白体内肿瘤活性评估：建立肝癌移植瘤模型，然后尾静脉注射重组蛋白进行治疗，评估重组蛋白在体内对肝癌致瘤性与肺转移能力的影响；9. 差异lncRNAs的筛选：分别提取HepG2/pLVX，HepG2/Frzb细胞总RNA，然后通过HTA 2.0芯片及新一代高通量测序技术lncRNA-seq筛选差异lncRNAs；10. 筛选获得差异lncRNAs的验证：通过半定量PCR，验证测序分析给出结果。11. 差异lncRNAs的功能预测：通过生物信息学KEGG信号通路分析，预测差异lncRNAs的功能；研究结果1. 成功获得七个克隆片段： CRD（Frzb CRD片段），Tum 5（Tumstatin Tum 5片段），VR1D（VEGFR1第二个IgG结构域片段），VR2D（VEGFR2第三个IgG结构域片段），ALK-1 ECD（ALK-1胞外区片段），WD（WIF-1 WD片段），FZD8 CRD（FZD8 CRD片段）；2. 成功获得六个融合基因，分别是CRD-CRD，CRD-Tum 5，CRD-VR1D-VR2D，CRD-FZD8 CRD，CRD-ALK-1 ECD，CRD-WD；3. 成功构建上述六个融合基因慢病毒重组表达质粒pLVX-puro-CRD-CRD，pLVX-puro- CRD-Tum 5，pLVX-puro-CRD-FZD8 CRD，pLVX-puro-CRD-WD；pLVX-puro-CRD-VR1D-VR2D， pLVX-puro-CRD- ALK-1 ECD；4. 成功获得上述六个融合基因重组慢病毒悬液，并感染肝癌HepG2细胞株，经一定浓度嘌呤霉素筛选成功建立稳定表达上述六个融合基因的肝癌细胞株；5. 裸鼠Xenograft Model结果表明，CRD-CRD，CRD-Tum 5，CRD-VR1D-VR2D，CRD-FZD8 CRD，CRD-ALK-1 ECD，CRD-WD六个融合基因均能显著抑制裸鼠皮下移植瘤生长，抑制率分别为52.1 %，73.1 %，100 %，81.2 % ，50.6 %与69.3 % (P < 0.01)，其中CRD-VR1D-VR2D，CRD-FZD8 CRD相比于单一结构域活性提升较为明显，同时鉴于CRD-VR1D-VR2D较强的抗癌活性，后续选择其进行表达纯化制备重组蛋白；6. 同源建模方法预测CRD-VR1D-VR2D结构与各单一结构域相似度高，且分子对接模拟表明CRD-VR1D-VR2D具有和Wnt配体相互作用的功能。荧光素酶报告基因检测进一步证实CRD-VR1D-VR2D可以抑制肝癌细胞Wnt信号转录活性，抑制率约39.3 % (P < 0.01)，同时免疫共沉淀结果显示CRD-VR1D-VR2D可以与Wnt1相互作用；7. 分别成功构建融合蛋白表达载体pGEX-6P-1-CRD-VR1D-VR2D和pET28a-CRD-VR1D-VR2D，然后在大肠杆菌（BL 21）表达系统中诱导表达CRD-VR1D-VR2D，结果显示，利用pET载体表达CRD-VR1D-VR2D可溶性很差，目的蛋白几乎不溶解，而利用pGEX-6P-1载体上带有的GST标签，能够明显增强CRD-VR1D-VR2D可溶性，然后通过Co2+柱和GST柱串联纯化CRD-VR1D-VR2D，最终获得纯度较高的CRD-VR1D-VR2D，产率约为0.01%。同时，成功构建pLVX-puro-CRD-VR1D-VR2D-Flag-His表达质粒，并获得稳定表达CRD-VR1D-VR2D的CHO细胞株；8. 通过HTA 2.0芯片实验筛选发现总共有 2868 个 lncRNA 差异表达，其中1124个 lncRNA 同时上调，1744个 lncRNA 同时下调；通过lncRNA-seq技术筛选获得171条差异lncRNAs，其中上调120条，下调51条；9. 验证发现lncRNA-seq中lncRNA-AC079466.1与测序结果相匹配，为在HepG2/Frzb中特异性上调的差异lncRNA；而挑选部分HTA 2.0芯片差异lncRNAs进行验证均呈现假阳性。 10. 通过KEGG信号通路分析预测表明，差异lncRNAs可能调控RIG-1样受体信号通路，细胞因子细胞因子 受体相互作用，半胱氨酸和甲硫氨酸代谢以及在小细胞肺癌中发挥重要作用； |
| 语种 | 中文 |
| 学科主题 | 天然产物研究 |
| 产权排序 | 1 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://210.75.237.14/handle/351003/28843]  |
| 专题 | 成都生物研究所_天然产物研究 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 曾中秋. 基于Wnt信号通路的新型重组蛋白抗肝癌活性以及相关长链非编码RNA的筛选[D]. 中国科学院大学. 2016. |
| 个性服务 |
| 查看访问统计 |
| 相关权益政策 |
| 暂无数据 |
| 收藏/分享 |
除非特别说明，本系统中所有内容都受版权保护，并保留所有权利。
修改评论