| 题名 | 小反刍兽疫病毒基本研究体系的建立及非结构蛋白功能研究 |
| 作者 | 高华峰 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2011-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 张华堂 |
| 关键词 | 小反刍兽疫病毒 反向遗传 非结构基因 调亡 I 型干扰素 |
| 其他题名 | Establishment of Basic Research Systems for Studies of PPRV Virology and Functions of Non-Structural Proteins |
| 学位专业 | 细胞生物学 |
| 中文摘要 | 小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)是副粘病毒科、麻疹病毒属的成员，因主要感染小反刍动物而得名，特别是山羊高度易感。国际动物卫生组织(OIE)将PPRV感染列为A类疫病，我国也将其列为一类动物疫病。该病主要在非洲及中东地区流行，近年来在我国周边国家频繁发生。自2007年我国西藏自治区首次报道该病疫情以来，现已严重威胁我国畜牧业的健康发展。 目前，国内外对小反刍兽疫的研究，主要集中在病毒及血清抗体检测等疫情监测的方法和应用方面，但是在PPRV与宿主细胞相互作用、致病机理以及反向遗传研究体系基础研究方面，尚无系统的研究报道。因此，建立相关的的基本研究体系，特别是反向遗传研究及病毒非结构蛋白功能研究，将有助于从理论上阐述病毒与宿主相互作用关系和致病机理，同时，在重组疫苗研究有直接的现实意义。 为此，本论文进行了以下几方面的研究： 1、PPRV弱毒疫苗株N75/1病毒培养、毒价测定以及全基因组序列的克隆和分析：将病毒按8个不同的稀释度接种敏感细胞Vero，经过染色观察，测定病毒的细胞半数感染量TCID50为105.36/mL；经提取病毒基因组RNA，反转录合成互补cDNA链，设计8对特异PCR引物，通过分段扩增用pfu酶扩增其7段，用GC rich buffer完成另一段扩增，完成PPRV全基因组序列的扩增；通过序列测定及分析比对，表明PPRV适应细胞后序列的主要改变发生在基因组3’端的调控区（GP区），未发现N75/1编码序列存在突变热点。 2、反向遗传基本研究体系的建立：在以上全长序列分析的基础上，以SKII为载体骨架，利用载体内的两个BssHII进行全长文库构建，完成PPRV全基因组拼接；在辅助质粒的构建方面，完成核蛋白N，磷酸化蛋白P及病毒基因组转录复制各元件的扩增；通过全基因合成，引入丁肝核酶的核心序列，并通过加入适当酶切位点与基因组5’端调控序列相连。 3、P基因编码蛋白P/V/C对I型干扰素产生的调控作用：副粘病毒通过磷酸化基因P经RNA编辑生成两种非结构蛋白V、C，这两种蛋白在病毒进化过程中具有多种功能。本研究扩增和构建P/V/C三个编码框后，以融合及非融合表达载体转染不同来源的传代细胞株，分析它们是否对Ⅰ型干扰素的产生具有抑制作用。 同时，本研究建立了三种不同组织及细胞样品分别为猴、Vero细胞、鸡胚成纤维细胞（CEFs），以IFNA、IFNB与持家基因GAPDH相对定量的Cyber green分析方法，发现蛋白C对poly(I:C)双链RNA诱导的IFNA产生有40%的下调作用，而对于IFNB则无明显抑制作用。 4、P/V/C诱导的调亡及坏死：以P/V/C转染Vero细胞，通过原位染色及细胞流式分析等方法，对调亡及坏死分析结果表明，蛋白C在转染后四天能引起20%的细胞坏死和25%的细胞发生调亡，而P和V仅有3-5%的细胞死亡率，明显低于对照载体的15-20%的死亡率。表明C基因的过量表达能引起细胞发生坏死及调亡。经G418筛选45天，在获得稳定表达的细胞系中，则不能检测出坏死及调亡。 5、P/V/C对病毒增殖的影响：本研究在建立PPRV病毒Taqman Realtime PCR检测方法的基础上，分析P/V/C过表达对病毒增殖的影响。结果表明，C基因的表达能在早期抑制病毒的增殖，P、V基因的表达对病毒复制无明显影响。 综上，鉴于国际国内PPRV研究中的空白点，本论文在以下几方面：（1）弱毒株培养及检测；（2）全基因组克隆测序；（3）反向遗传学基本研究体系建立；（4）P/V/C蛋白对病毒本身增殖复制的作用；（5）P/V/C对宿主细胞干扰素产生能力的影响；（6）P/V/C能否造成宿主细胞调亡和坏死等几方面进行了较有针对性的尝试和探索，为PPRV分子病毒学研究以及致病机理重组疫苗研究奠定了必要的基础。 |
| 英文摘要 | Peste des petits ruminants（PPR） is an economically important disease of domestic and wild ruminants. The disease is caused by Peste des petits ruminants（PPRV）, which is classified in the genus Morbillivirus in the family Paramyxoviridae. PPRV causes high mortality in its host species, sheep and goats. It was listed as A disease by World Animal Health Organization(OIE), Chinese government also lists this disease as A disease, Serologic and molecular evidence indicates that peste des petits ruminants virus infection has emerged in goats and sheep in the Ngari region of southwestern Tibet, People's Republic of China. This emergence disease is becoming a threat for the health development of husbandry industry in China. Current studies about this disease mainly focus on virus detection and serology surveillance, no researchs about how the virus interrater with the host cell and which mechchism influence virus infection. Recombinant virus is also studied by different research groups. But there is still no successful rescue report about PPRV. So, it is urgent to make more studies about the virus rescue system by reverse genetic thus to know how the non-structure protein interact with the host cells. This thesis make the studies on PPRV from the following aspects: |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2011-09-21 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://159.226.149.42:8088/handle/353002/6801]  |
| 专题 | 昆明动物研究所_分子免疫生物学 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 高华峰. 小反刍兽疫病毒基本研究体系的建立及非结构蛋白功能研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2011. |
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