| 题名 | SEA的基因克隆及高效表达工程菌的构建 |
| 作者 | 时成波 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2002 |
| 授予单位 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院沈阳应用生态研究所 |
| 关键词 | 表达载体 克隆 重叠PCR 均匀设计 |
| 学位专业 | 微生物学 |
| 中文摘要 | Staphylococcal enterotoxin A(SEA）是由金黄色葡萄球菌分泌至胞外的一种单亚基蛋白质。它能与抗原递呈细胞上的MHC II受体结合，激发大量T细胞活化，释放多种细胞因子。正是由于SEA是一种强的T细胞激活剂，近年来，它在肿瘤的免疫治疗中显示出巨大的应用潜力。本文总结了国内外近十几年来在SEA治疗肿瘤方面的研究成果，指出，SEA靶向药物及低毒性SEA分子改造是SEA类药物研究的方向。利用PCR方法从金葡菌基因组DNA中扩增出seap基因（即SEA前体基因，含信号肤编码区），采用重叠PCR技术突变了694佩714碱基之间的所有稀有密码子，得到seap，。基因表达结果证实，改造seap基因中稀有密码子对提高基因表达水平非常有效。对seap基因中关键稀有密码子的突变在国内外尚属首次。以seapm为模板采用PCR方法扩增出seam (SEA成熟蛋白基因）。自行设计，自行构建成功一个新型原核表达载体7ZTS。它具有克隆，测序和表达在同一载体上进行，并可依据蓝白反应挑选重组子的特征。7ZTS表达载体将多种功能集于一体的独特优点是目前已知表达载体所不具备的，其大大简化了分子生物学操作步骤，提高了工作效率。利用7ZTS表达载体，在大肠杆菌JM109（DE3)中表达了mseap和seam基因。前者以包含体形式表达出SEA前体蛋白，后者以包含体和可溶性两种形式存在。通过均匀设计方法，摸索出'0sea基因表达的最佳条件为：诱导前生物量ODEo。为0. 8，装液量为28%，诱导温度为37'C，诱导时间为8小时。在此条件下，SEA表达量占细胞总蛋白的37%，可溶性SEA约占70%o SEA如此高效的表达为国内一外首次报道。质粒稳定性实验表明，7ZTS一msea重组质粒具有极好的稳定性，连续培养72小时或IPTG诱导48小时后，质粒基本不丢失。以上实验结果为SEA的大规模制备和SEA导向药物的研究开发奠定了基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2010-12-15 ; 2011-04-29 |
| 页码 | 99 |
| 内容类型 | 学位论文 |
| 源URL | [http://210.72.129.5/handle/321005/3121]  |
| 专题 | 沈阳应用生态研究所_沈阳应用生态研究所_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 时成波. SEA的基因克隆及高效表达工程菌的构建[D]. 中国科学院沈阳应用生态研究所. 中国科学院沈阳应用生态研究所. 2002. |
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